穿刺抽吸法誘導兔椎間盤退變模型

白亦光，韓小偉，張旭乾，陳華平，趙 明，劉 康，陳 竹，楊澤龍，倪 偉，馮 剛

(1.川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所·南充市中心醫院;2.南充市中心醫院病理科;3.南充市中心醫院醫學影像科，四川 南充 637000)

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椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因，它可引起一系列疾病如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥、節段性腰椎不穩和退變性腰椎側凸等。目前關于IDD 的病因和病理生理機制尚未完全明確。椎間盤退變的過程牽涉到一系列復雜的形態學、生物力學、生物化學和生物學行為的改變［1］。一種可靠的椎間盤退變動物模型必將有助于椎間盤退變的病理機制研究。椎間盤退行性變模型的制作國內外已有報道，本實驗使用纖維環穿刺法建立兔椎間盤退變模型，觀察退變椎間盤的影像學和組織病理學表現。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗方法

取10 月齡日本大白兔12 只(川北醫學院實驗動物中心提供)，雌雄不限，體重2.5 ～3.0 kg。經MRI 檢查排除脊柱的先天性畸形和椎間盤退變。所有動物以濃度為10 mg/mL 的戊巴比妥3 mL/kg 進行耳緣靜脈注射麻醉。取仰臥位，備皮后常規碘伏消毒，取腹部正中切口，切口長約10 cm，小心將腸管翻出，分離椎體前方肌肉，保護椎體前方動脈血管，暴露L1 ～2 至L6 ～7 節段椎間盤。其中L3 ～4、L4 ～5、L5 ～6 節段椎間盤用21 號針頭接5 mL 注射器在椎間隙纖維環的中點平行于終板方向刺入纖維環5 mm，回抽注射器針筒至3 mL 處維持15 s，抽取髓核組織約8 ～10 mg。L1 ～2、L2 ～3 及L6 ～7 節段只暴露椎間盤不做穿刺抽吸。術畢逐層縫合創口，大腿內側肌肉注射青霉素80 萬U 抗感染。動物分別于術后4、8、12、16 周各取3 只進行指標檢測MRI檢查，然后處死實驗動物獲取椎間盤，利用病理組織學觀察。

1.2 檢測指標

1.2.1 MRI 檢查 分別于術后2、4、8、12 周每組隨機選取2 只動物麻醉后(麻醉方法同上)進行MRI檢查。取仰臥位對兔腰椎行T2加權像(T2WI)掃描，系列重復時間/回波時間(TR/TE)為2 800/100 ms，層厚3 mm，間距0.5 mm。以Pfirrmann 改良分級法［2］作為評估標準，根據T2WI 像兔椎間盤信號強度將退變分為4 級:4 級，正常椎間盤;3 級，信號部分減弱;2 級，信號完全減弱;1 級，信號完全減弱伴椎間盤高度丟失。所有MRI 影像資料均由放射科醫師盲法閱片評估。

1.2.2 大體形態學觀察 術后2、4、8、12 周10 mg/mL 的戊巴比妥6 mL/ kg 過量麻醉處死動物，取各動物L2 ～3(假手術對照節段)、L3 ～4(穿刺抽吸節段)椎間盤標本，10%多聚甲醛固定24 h，矢狀位切開椎間盤標本，觀察纖維環和髓核分界是否清楚，髓核是否為膠凍狀。

1.2.3 椎間盤組織病理學表現 取各動物L6 ～7(假手術對照節段)、L5 ～6(穿刺抽吸節段)椎間盤標本，10%多聚甲醛固定，脫鈣液脫鈣6 d，矢狀位切開椎間盤標本，石蠟包埋切片(片厚5 μm)、番紅“O”染色觀察，并用倒置顯微鏡照相采集圖像。番紅“O”染色流程:切片二甲苯酒精脫蠟至水;蘇木素染10 min，水洗;0.2%亮綠染色10 min，水洗;0.1%番紅“O”染色10 min，1%醋酸酒精分化液3 s，封片后鏡下觀察。

1.3 統計學分析

實驗數據應用SPSS13.0 統計學軟件處理。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05，有統計學意義。

2 結果

2.1 MRI 表現

造模手術后4 周開始，纖維環穿刺組髓核T2WI信號明顯下降(P ＜0.05)。造模術后4、8、12、16 周髓核T2WI 信號隨時間延長逐步降低，高信號面積逐漸縮小，假手術對照節段的髓核信號強度在觀察期內無明顯變化(圖1);各時間點椎間盤分級的分值見表1，從術后4 周開始兩組差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 椎間盤退變MRI 分級

2.2 大體形態學觀察

術后4 周，穿刺抽吸節段椎間盤均出現不同程度椎間盤高度降低，纖維環紋理清晰，結構完整，未見骨性贅生物形成;8 周時穿刺抽吸節段椎間盤可見椎體邊緣贅生物，為纖維環鈣化形成，纖維環可見結構紊亂，髓核失去凝膠狀形態;12 周出現明顯退變，椎間盤高度丟失，椎緣出現骨性贅生物，纖維環結構紊亂，髓核變性，結構模糊。假手術對照節段各椎間盤高度維持良好，髓核呈透明凝膠狀，椎體緣無增生組織(圖2)。

2.3 組織病理學表現

假手術對照組動物椎間盤結構髓核完整，與纖維環分界清楚，染色呈紅色，纖維環排列有序，髓核內可見成團分布的髓核細胞簇，細胞外基質豐富;纖維環穿刺組番紅“O”組織染色顯示退變椎間盤組織中髓核組織含量隨時間延長明顯降低，造模術后4 周髓核組織中髓核細胞含量減少，形態不規則，分布不均勻，纖維軟骨組織增生，排列紊亂。第12 周時髓核中主要為纖維軟骨組織，伴有極少量髓核細胞(圖3)。

3 討論

人類椎間盤退變早期病理學改變主要表現為蛋白多糖、Ⅱ型膠原含量的減少進而髓核的含水量下降［3］。關于椎間盤退變的原因目前尚不清楚［4］，其發病機制機制和早期治療修復的方法一直是近年來的研究熱點［5］。建立一個好的模型有助于我們進行椎間盤退變的相關實驗研究。本實驗日本大白兔采用經腹纖維環穿刺抽吸法具有手術暴露充分、操作性好、切口大小易于掌握、重復性好、模型制作成功率高等優點。

本實驗通過MRI 來觀察造模術后隨著時間延長兔椎間盤退變的程度。MRI 能夠提供清晰的椎間盤圖像，是評估椎間盤退變常用的評價方法。退變椎間盤由于內部蛋白多糖及水分丟失造成的改變，以及Ⅱ型膠原的減少及Ⅰ型膠原的增加使椎間盤抗壓縮和拉伸性能減弱，導致椎間盤生物學性能發生改變，這些變化表現在MRI 上，可看到代表含水量的T2WI 信號強度減弱并有椎間隙狹窄［6］。本實驗造模術后椎間盤髓核組織MRIT2WI 信號強度呈現逐漸降低趨勢，術后時間越長髓核組織退變越明顯，而假手術對照組的髓核組織T2WI 信號強度無明顯變化。以上實驗結果證實通過纖維環穿刺髓核抽吸方法可以誘導大白兔椎間盤發生退變，這種退變是一個緩慢漸進的過程，較為符合人類椎間盤退變的病理變化。

椎間盤組織番紅“O”染色顯示，假手術對照節段椎間盤可見髓核組織完整，外周纖維環呈環狀排列，可見明顯的軟骨細胞及基質;穿刺抽吸節段椎間盤術后4 周見椎間盤組織染色呈紅色，中央髓核區域類結構模糊，出現裂隙，細胞數量減少，結構較正常髓核致密，纖維粗大，排列紊亂，椎間盤高度降低。術后8 周后可見整個中央髓核區域類圓形結構消失，與周圍纖維環組織融合，出現排列紊亂的條索樣纖維結構，出現裂隙，細胞數量明顯減少，椎間盤高度降低。術后12 周髓核番紅“O”染色顯示，髓核組織中條索樣纖維結構更加紊亂，蛋白聚糖含量明顯減少，椎間盤高度明顯降低。

有研究者認為髓核組織是與機體免疫系統相隔絕的，為免疫豁免組織，纖維環或軟骨終板這一生理屏障受到破壞后，髓核組織就暴露于機體的免疫系統之中，進而激發一系列的自身免疫反應，導致髓核細胞凋亡進而椎間盤退變［7］。本方法即模擬這一發病機制，通過穿刺抽吸將髓核暴露于機體免疫系統。符合人類腰椎間盤退變的基本病理過程，且模型制作較為簡單，重復性好，可以作為研究椎間盤退變的動物模型，構建的椎間盤退變模型能為進一步研究椎間盤退變的病理機制及臨床治療提供可靠科研平臺。

［1］ 崔力揚，劉尚禮，丁 悅，等.大鼠腰椎間盤針刺退變模型的建立［J］.中國矯形外科雜志，2007，15(13):1008 －1011

［2］ Pfirrmann CW，Metzdorf A，Zanetti M，et al.Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration ［J］.Spine，2001，26(117):1873 －1878

［3］ Niosi CA，Oxland TR.Degenerative mechanics of the lumbar spine［J］.Spine J，2004，4(6 Suppl):202S－208S

［4］ Haixiang Liang，Shen-Ying Ma，Gang Feng.Therapeutic effects of adenovirus-mediated growth and differentiation factor-5 in a mice disc degeneration model induced by annulus needle puncture［J］.The Spine Journal，2010，10(1):32 －34

［5］ Zhou H，Hou S，Shang W，et al.A new in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration characterized by MRI，radiography，CT/discogram，biochemistry andhistology ［J］.Spine，2007，32(8):864 －872

［6］ Marinelli NL，Haughton VM，Mu?oz A，et al.T2 relaxation times of intervertebral disc tissue correlated with water content and proteoglycan content［J］.Spine (Phila Pa 1976)，2009，34(5):520 －524

［7］ Urban JP，Roberts S.Degeneration of the intervertebral disc［J］.Arthritis Res Ther，2003，5(3):120 －130