傷寒沙門菌高滲誘導基因osmY的克隆表達與多克隆抗體的制備

翁曉琴，張紅，詹莉芳，張曉磊，生秀梅，徐順高，黃新祥

(江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇 鎮江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種人類重要的致病性革蘭陰性桿菌，通過食源性傳播導致一種全身系統性疾病—傷寒癥，這種疾病在不發達地區仍有暴發［1］。細菌可以適應廣范圍的外環境滲透壓變化，其分子機制非常復雜［2］，例如傷寒沙門菌從食物的低滲環境突然進入腸道的高滲環境中，為了抵御高滲應激，許多細胞膜蛋白的表達量會發生變化，特別是那些周質蛋白(periplasmic protein)，如ProU和OsmY 蛋白等［3－4］。

在大腸埃希菌中，osmY基因是一種滲透壓誘導基因，其表達依賴于RpoS的激活［5］。在高滲應激的條件下，osmY基因的表達量明顯升高8～10倍，能編碼一種相對分子質量約22×103的周質蛋白OsmY，有研究者推測OsmY蛋白是運輸某種滲透物的載體，但其確切功能至今未知［6］。我們通過基因表達譜分析發現，在高滲應激早期，傷寒沙門菌osmY基因缺陷株與野生株相比，有許多重要功能的基因表達發生變化，其中包括Vi莢膜基因、菌毛基因和侵襲相關基因等［7］。所以我們猜測，在高滲應激的環境下，OsmY蛋白可能作為一個重要蛋白參與調節某些基因的表達，或者與其他相關蛋白相互作用來幫助細菌抵御高滲環境。

本研究擬克隆表達重組蛋白OsmY－His6并制備兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進一步研究OsmY蛋白在高滲應激環境中所發揮的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 野生型 S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大學醫學院微生物學教研室饋贈;E.coli JM109(DE3)和質粒 pET22b(+)由本室保存。

1.1.2 主要試劑與材料 DNA聚合酶pfu和預染蛋白標準參照物均為Fermentas公司產品;rTaq、緩沖液、dNTP、DL2000、限制性內切酶 NcoⅠ和 XhoⅠ、T4DNA連接酶均為TaKaRa(大連)公司產品;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品;IPTG為Promega公司產品;質粒提取試劑盒為Axygen公司產品。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(Eppendorf)，凝膠成像分析系統和蛋白電泳儀(Bio－Rad)，PCR擴增儀2720 Thermal Cycler(ABI)，核酸檢測儀(Nano－Drop)，恒溫搖床(Thermo scientific)，JY92－IIDN 超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.4 實驗動物 家兔2只(江蘇大學實驗動物中心)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和目的基因的獲取 利用基因庫獲取傷寒沙門菌osmY基因的核苷酸序列618 bp，通過Oligo 6.0軟件設計PCR特異性上下游引物P－osmY－A/B，并分別在引物5'端加接NcoⅠ和XhoⅠ的特異性酶切序列，由上海生工生物技術公司合成，P－osmY－A:

GACCATGGATATGACTATGACAAGACTG(下劃線為 NcoⅠ酶切位點)，P－osmY－B:

ATCTCGAGCTGAACTTTCAGATCGTT(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。從LB平板挑取傷寒沙門菌GIFU 10007菌落，加入1 mL去離子水并振蕩混勻，100℃ 煮10 min，離心取上清(含基因組DNA)，以上清為模板，以P－osmY－A/B為引物，用高保真 DNA聚合酶 pfu擴增目的基因osmY。

1.2.2 重組質粒的構建與鑒定 用酚仿－乙醇法純化PCR產物，純化后的PCR產物和表達載體pET22b(+)經NcoⅠ和Xho I雙酶切后，酶切產物經酚仿－乙醇法純化后用T4DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產物熱激轉化入E.coli JM109，從轉化平板上挑取24個菌落接種在24等份含氨芐西林的LB平板上增菌培養過夜，將上述菌體和空載體轉化菌體收集于30 μL蒸餾水的EP管中，向EP管中再加30 μL 酚/氯仿/異戊醇(25 ∶24 ∶1)混合液，在振蕩器上劇烈振蕩，離心取10 μL上清，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選含陽性質粒的細菌。提取陽性克隆質粒，用PCR和雙酶切驗證陽性質粒，再通過DNA測序分析確認陽性質粒的序列正確(測序分析由上海生工生物技術公司完成)。原理見圖1。

圖1 傷寒沙門菌pET22b(+)-osmY重組質粒的構建原理Fig 1 The schematic diagram of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

1.2.3 OsmY蛋白表達條件 挑取分別含重組質粒 pET22b(+)－osmY和空質粒 pET22b(+)的E.coli JM109于1 mL LB培養液中(氨芐西林0.1 mg/mL)，37℃振搖過夜，然后以1∶100的比例轉接入20 mL LB培養液中，37℃振搖2～3 h至D(600 nm)為0.5，加入 TPTG 至終濃度為1 mmol/L，于18 ℃振搖誘導 12 h［8］，冰浴 10 min，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，用500 μL PBS緩沖液重懸菌沉淀，250 μL菌液用于全菌蛋白電泳，另外250 μL菌液用于4℃超聲至清亮，12 000 r/min離心15 min，取上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳。

1.2.4 OsmY蛋白的純化 用上述誘導條件1 000 mL培養重組表達菌，冰浴 10 min，4℃，10 000 r/min離心10 min后取菌沉淀，并用PBS緩沖液(pH7.2)洗滌3次，將菌沉淀稱重，在菌沉淀中加入相應體積的非變性結合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪 唑 pH 8.0)(10 mL非變性結合緩沖液/1 g菌)，4℃超聲破碎后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清液。用非變性結合緩沖液平衡Ni柱，再將收集的上清液以1 mL/min的速度上樣于Ni柱，用非變性洗滌緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗滌雜蛋白，直至紫外分光光度儀檢測蛋白質量濃度接近0 μg/mL，此時用非變性洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑 pH 8.0)洗脫融合蛋白，共收集5 mL，用紫外分光光度儀檢測蛋白質量濃度并用SDS－PAGE電泳鑒定純度。

1.2.5 兔抗 OsmY蛋白多克隆抗體的制備 用PBS緩沖液透析收集的融合蛋白OsmY－His6以去除咪唑，將透析好的融合蛋白OsmY－His6與等體積的弗氏完全佐劑研磨至完全乳化，每只家兔以1 mL乳化的免疫原(含50 μg融合蛋白)，背部皮下多點注射。每隔2周將抗原與等體積的弗氏不完全佐劑研磨至乳化后免疫家兔，共免疫4～5次，末次免疫1周后頸動脈放血并獲得抗血清，用半飽和硫酸銨鹽析法和透析除鹽法獲得粗提的多克隆抗體，分裝后保存于－20℃［9］。用雙向免疫瓊脂擴散法測定抗體效價，用蛋白質印跡法檢測多克隆抗體與抗原反應的特異性。

2 結果

2.1 傷寒沙門菌 pET22b(+)－osmY重組質粒的構建

以S.Typhi野生株 GIFU 10007為模板，PCR擴增得到約633 bp的DNA片段，經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后與表達載體pET22b(+)相連接，連接產物轉化入E.coli JM109，篩選陽性克隆質粒，并提取初篩陽性質粒pET22b(+)－osmY，經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切與PCR鑒定，osmY基因已經成功與表達載體pET22b(+)相連(圖2)。

2.2 重組蛋白OsmY－His6的表達與純化

帶有重組質粒 pET22b(+)－osmY的 E.coli JM109在18℃、TPTG終濃度為1 mmol/L的條件下誘導12 h后，經SDS－PAGE電泳鑒定:在超聲后上清中可見大量的重組蛋白OsmY－His6，該上清經Ni柱純化后獲得重組蛋白OsmY－His6(圖3)。

圖2 傷寒沙門菌pET22b(+)-osmY重組質粒的構建Fig 2 Preparation of the pET22b(+)-osmY vector of S.Typhi

圖3 重組蛋白OsmY-His6的表達與純化Fig 3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein OsmY-His6expression and purification

2.3 兔抗OsmY－His6蛋白的多克隆抗體制備

以純化的OsmY－His6蛋白為免疫原免疫家兔，獲得兔抗OsmY－His6的多克隆抗體，用雙向免疫瓊脂擴散測定效價為1∶8。蛋白質印跡顯示多克隆抗體與抗原反應的特異性良好(圖4)。

圖4 抗體特異性的免疫印跡鑒定Fig 4 Western-blotting analysis of the anti-OsmY polyclonal antibody

3 討論

傷寒沙門菌(S.Typhi)是沙門菌屬中一種重要的人類腸道致病菌，通過污染的食物進入消化道后，侵入空腸M上皮細胞，并能在M細胞中存活和增殖，最終可穿過腸系膜淋巴組織進入淋巴循環和血液循環，從而進入肝、脾和腎等臟器，造成系統性感染［10］。在這個致病過程中，傷寒沙門菌需要克服腸道的高滲環境，其分子機制非常復雜，主要通過兩種途徑:一是蛋白活性的調節，作為一種立即反應;二是基因轉錄的調節，作為一種長期反應。細菌必需產生許多化學分子將環境外部的刺激信號轉導入細胞內部，從而來實現這兩種途徑［11］。

大腸埃希菌在高滲應激的條件下，周質空間中的某些蛋白的表達量增多，如ProU和OsmY蛋白等［3－4］。周質空間又稱壁膜空間，位于細胞壁與細胞膜之間的狹窄間隙，含有多種蛋白質，例如蛋白酶、核酸酶等各種水解酶和運送某些物質進入細胞內的結合蛋白，以及趨化性的受體蛋白等。osmY基因是一種滲透壓誘導基因，在高滲應激的條件下，其表達量明顯升高8～10倍，能編碼相對分子質量約為22×103的周質蛋白OsmY。所以有研究者推測OsmY蛋白是運輸某種滲透物的結合蛋白，但其確切功能至今未知［6］。我們的前期實驗發現，與傷寒沙門菌野生株相比，osmY基因缺陷株在高滲應激早期，有許多基因的表達量發生顯著變化，有表達量上調的基因(tviA、fimA、treC等)和表達量下調的基因(otsB、fimA、rpoS 等)［7］。據此，我們猜測 OsmY 蛋白在高滲應激的條件下可能有3種作用，一是作為調節蛋白來調節某些基因的表達;二是與其他相關蛋白相互作用來調節蛋白活性;三是作為結合蛋白來運輸某種滲透物。

本研究克隆表達了重組蛋白OsmY－His6并制備兔抗重組蛋白的多克隆抗體，為進一步研究OsmY蛋白在高滲應激環境中所發揮的功能提供了基礎。

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