卟啉為核的星形聚己內酯-嵌段-聚乙二醇的合成及釋放性能

黃雅菲，戈延茹，戚雪勇，戴曉暉

(江蘇大學1.藥學院，2.化學化工學院，江蘇 鎮江 212013)

卟啉類化合物存在大π共軛結構，在紫外可見區有強吸收，對光具有良好的靈敏性，而且具有腫瘤靶向性，對正常組織毒性小，可作為抗腫瘤光動力治療(photodynamic therapy，PDT)的光敏劑［1］。但傳統的小分子卟啉存在較強的π－π及疏水相互作用，在生物體內形成聚集體，造成其光量子效率低，即發生光自淬滅。因此，以卟啉為內核，通過高分子功能化，再利用高分子自組裝，獲得含卟啉藥物核的靶向型高分子納米微粒，有望高效地把高濃度的光敏藥物遞送到病灶部位［2－4］。

我們以四(4-羥乙基苯基)卟啉為引發劑，通過開環聚合和酯化反應制備了卟啉為核的星形聚己內酯-嵌段-聚乙二醇［star-shaped porphyrin-cored poly(caprolactone)-block-poly(ethylene glycol)，SPPCL-b-PEO］。在該共聚物分子中，四臂大分子骨架可有效延緩卟啉內核的自淬滅，在臨床癌癥治療中，能極大限度保留卟啉內核的光動態療效。而且親水聚乙二醇(polyethylene glycol，PEO)鏈段能有效改善疏水聚己內酯(poly caprolactone，PCL)鏈段的高結晶度和疏水性［5－6］。這些特性使得該共聚物載藥納米微球滿足靶向給藥系統的要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

四(4-羥乙基苯基)卟啉的制備依照文獻［7－9］。單甲氧基聚乙二醇(monomethoxy polyethylene glycol，MPEO，Aldrich，Mn=2000/5000)、4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP，Aldrich)、雙環己基碳酰亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC，上海國藥集團)真空干燥8 h后使用;異辛酸亞錫(SnOct2，Aldrich)、琥珀酸酐(succine anhydride，上海國藥集團)、1，4-二氧六環(1，4-dioxane，上海國藥集團)直接使用;ε-己內酯(ε-caprolactone，百靈威科技有限公司)、甲苯(toluene，上海國藥集團)減壓蒸餾后使用;二氯甲烷(CH2Cl2，上海國藥集團)、三乙胺(上海國藥集團)加CaH2回餾12 h后蒸出。其他所有溶劑未經說明均不作任何處理。

凝膠滲透色譜(gel permeation chromatograph，GPC)由配有2根Mixed-B柱子(Polymer Lab公司，孔徑10 μm，柱子尺寸為300 mm×7.5 mm)的 Perkin-Elmer Series 200凝膠滲透色譜儀(美國鉑金埃爾默公司)測得;核磁共振譜(nuclear magnetic resonance spectrum，NMR)由Varian Mercury-400核磁共振譜儀(美國瓦里安公司)測得;紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)由 Nicolet Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀(美國尼高力公司)測得;紫外可見光譜(ultraviolet visible spectroscopy，UV-vis)由N-2450高效紫外可見分光光度計(日本島津公司)測得;熒光激發光譜由Varian Cary Eclipse熒光分光光度計(美國瓦里安公司)測得;透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)照片由 JEOL JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子公司)拍攝。

1.2 實驗方法

1.2.1 共聚物的合成

1.2.1.1 卟啉為核的星型聚己內酯［porphyrincored star-shaped poly(caprolactone)，SPPCL］的合成SPPCL24(聚合度和分子質量的值見表1)的合成方法依照我們以前的文獻報道［10］。加 入 ε-CL(309 mg，2.71 mmol)和四(4-羥乙基苯基)卟啉(19.5 mg，0.023 mmol)于干燥的試管中，用翻口塞封口，抽真空通氮氣3次后放入120℃恒溫油浴鍋中磁力攪拌5 min，再用微量進樣器加入含SnOct2(1.1 mg，2.75 μmol)的甲苯溶液，120 ℃ 下磁力攪拌反應24 h。將試管冷卻至室溫，所得固體溶解于2 mL的CH2Cl2中，然后沉降于100 mL冰甲醇中。過濾后所得產物，在40℃下真空干燥至恒重。產量316.4 mg，產率96.3%。

1.2.1.2 端羧基化聚乙二醇(carboxyl-terminated monomethoxy polyethylene glycol，CMPEO)的合成制備過程依照文獻［11－12］，以CMPEO2000的合成為例。稱取 MPEO(Mn=2 000，2.0 g，1.0 mmol)，丁二酸酐(152.4 mg，1.5 mmol)，DMAP(123.2 mg，1.0 mmol)溶解于10 mL無水1，4-二氧六環中，然后加入三乙胺(140 μL，1.0 mmol)，室溫下攪拌反應24 h。反應混合液旋轉蒸發掉溶劑，將固體溶于少量CH2Cl2中，然后攪拌下逐滴沉降于100 mL冰乙醚中，產物過濾后，40℃下真空干燥至恒重。產量1.61 g，產率85.5%。

1.2.1.3 卟啉為核的星型聚己內酯-嵌段-聚乙二醇(SPPCL-b-PEO)的合成 SPPCL-b-PEO是通過SPPCL 和 CMPEO 發生酯化反應合成的［11－12］。以SPPCL24-PEO5000的合成為例，稱取 SPPCL24(Mn=11 356，113.6 mg，0.01 mmol)，CMPEO 5 000(Mn=5 000，225.0 mg，0.045 mmol)，DCC(16.3 mg，0.08 mmol)和 DMAP(1.9 mg，0.015 mmol)溶解于2.0 mL無水CH2Cl2中，室溫氮氣流下攪拌反應24 h。旋轉蒸發掉溶劑，將殘渣溶于適量 CH2Cl2中，然后沉降于冰乙醚中，過濾得粗產物。粗產物使用乙醚和苯混合溶液(2∶1，mol∶mol)純化，所得產物40℃下真空干燥至恒重。產量235.8 mg，產率75.2%。

1.2.2 大分子骨架對卟啉核的屏蔽效應研究 依據文獻［13－15］，將 1，3-二苯基異苯并呋喃(1，3-diphenylisobenzofuran，DPBF)配制成濃度為 10－6mol/L的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，同時將樣品四(4-羥基苯基)卟啉(THPPH2)、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000分別配制成濃度為1.5×10－4mol/L的DMF溶液。取5 μL上述樣品溶液加入到5 mL上述DPBF溶液中，立即測定混合溶液在激發波長(Ex)403 nm處的熒光激發光譜并記錄其熒光強度。然后用激光對其照射300 s，期間每30 s測定1次上述Ex處的熒光激發光譜并依次記錄相應熒光強度。

1.2.3 SPPCL-b-PEO共聚物自組裝膠束的制備所有樣品的膠束溶液用透析法制備。具體操作如下:4 mg共聚物樣品溶解于1 mL DMF中，磁力攪拌下，用微量進樣器將該溶液以10 μL/min的速度逐漸滴加到2 mL蒸餾水中，在室溫下繼續攪拌24 h使制備的聚集體平衡，然后裝入透析袋(截留分子質量為7 000)，在1 L的蒸餾水中透析72 h除去DMF，每隔12 h換水1次。

1.2.4 藥物包載與釋放

1.2.4.1 多柔比星載藥納米微球的制備 用透析法制備負載多柔比星的SPPCL-b-PEO納米微球，制備方法參考文獻［16－17］。稱取10.0 mg SPPCL24-PEO5000溶解于 6.5 mL DMF，稱取 2 mg(3.4 μmol)鹽酸多柔比星(DOX-HCl)溶解于1 mL DMF并加入1.5倍當量(5.1 μmol)的三乙胺中和，一段時間后，將兩溶液混合攪拌片刻。向溶液中滴加10 mL的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.4)，攪拌24 h。將混合溶液裝入透析袋(截留分子質量為7 000)，在1 L的蒸餾水中透析72 h，每12 h換水1次，除去DMF。最后通過冷凍干燥得到載藥納米粒子凍干粉。

1.2.4.2 包封率和載藥量的測定 稱取載藥膠束凍干粉1 mg溶于10 mL DMF中，通過UV-vis測定載藥量和包封率。多柔比星的檢測波長為500 nm，對應的標準曲線:D=0.020 2C+0.0037(R=0.999 8)。膠束的載藥量和包封率分別按以下公式計算:載藥量=微球中所含的藥量/微球的總質量×100%;包封率=微球中所含的藥量/投入的總藥量×100%

1.2.4.3 負載多柔比星的SPPCL-b-PEO納米微球的體外釋放參考文獻［16-17］，將2 mg的負載多柔比星的SPPCL24-PEO5000納米微球溶解于2 mL PBS緩沖溶液 (pH 7.4/5.6)，然后放入透析袋中(截留分子質量為7 000)，將透析袋浸入裝有10 mL PBS緩沖溶液的小瓶中，37℃下恒溫振蕩進行釋放。每隔一定時間取出1 mL PBS溶液，并加入1 mL新的PBS溶液。用UV-vis分別測得不同時間點所取溶液的光密度，通過標準曲線計算各時間點多柔比星的濃度，由以下公式計算累積釋藥量:

Er:多柔比星累積釋放量(%);Ve:PBS溶液的置換體積，1 mL;Ci:第i次置換取樣時釋放液中藥物的質量濃度(μg/mL);V0:PBS釋放液的總體積，12 mL;mdrug:載藥膠束中多柔比星的質量(μg);n:PBS溶液的置換次數;Cn:第n次置換取樣時釋放液中藥物的質量濃度(μg/mL)。

2 結果

2.1 SPPCL-b-PEO嵌段共聚物的合成

一系列的SPPCL-b-PEO共聚物通過兩步反應得到。首先，四(4-羥乙基苯基)卟啉在SnOct2催化下，引發ε-CL單體的開環聚合(ring-opening polymerization，ROP)得到了結構規整的星型端羥基聚己內酯(SPPCL-OH)。然后，室溫下SPPCL-OH的末端羥基與CMPEO的末端羧基在DMAP/DCC催化體系下，直接發生酯化縮聚反應生成了SPPCL-b-PEO。合成路線見圖1所示，n和m分別表示共聚物中PCL鏈段的重復單元數和PEO鏈段的相對分子質量。

圖2是SPPCL和SPPCL-b-PEO的GPC曲線，均得到狹窄的單峰，隨著相對分子質量增加，峰值向短流出時間方向移動，說明反應具有良好的可控性。由GPC測定的聚合物的數均分子質量Mn，GPC大于其理論相對分子質量Mn，th(表1)，可能是因為星形聚合物的流體力學體積與作為標樣的線性聚苯乙烯不一樣引起的［18－19］。

圖3(1)為聚合物SPPCL的1H NMR譜圖，很明顯，位于 δ1.35 ～1.45(δH3)、δ1.55 ～1.79(δH2)、δ2.28 ～2.43(δH1)和 δ4.05 ～4.19(δH4)處出現了歸屬于PCL重復單元的典型質子峰，位于 δ4.48(δH13)、δ4.64(δH12)、δ7.52(δH9)、δ8.11(δH10)和δ9.21(δH11)處出現了歸屬于卟啉核的典型質子峰。除此之外，δ3.68處還出現了PCL鏈段末端的羥基亞甲基(HOCH2)的質子信號峰(δH5)，該峰與卟啉核中任意質子峰的積分面積之比均近似于1。這些都證明了在SnOct2催化下，四(4-羥乙基苯基) 卟啉能夠有效引發ε-己內酯單體的本體開環聚合。

圖1 SPPCL-b-PEO共聚物的合成路線Fig 1 Synthesis of SPPCL-b-PEO copolymers

表1 SPPCL和SPPCL-b-PEO制備參數和相對分子質量Tab 1 Preparation parameters and molecular weight data for SPPCL and SPPCL-b-PEO

圖2 SPPCL和SPPCL-b-PEO的GPC曲線Fig 2 GPC traces of SPPCL and SPPCL-b-PEO

SPPCL的實際分子質量(Mn，NMR)與理論分子量Mn，th的值基本符合，具體值見表1。與SPPCL比較，共聚物SPPCL-b-PEO的1H NMR［圖3(2)］中出現了幾個新的質子峰 δ2.67(δH6)、δ3.66(δH7)、δ3.39(δH8)。δH7和 δH8分別為 PEO 中重復單元和末端甲氧基(—OCH3)的質子峰，δH6屬于共聚物PCL和 PEO連接處的亞甲基(—CH2—)質子峰。PCL鏈段的端基信號峰(δH5)在SPPCL-b-PEO中完全消失了。比較SPPCL和SPPCL-b-PEO的13C NMR(圖4)，SPPCL-b-PEO 在 δ29.2和 δ70.3處分別出現了新的峰δhC和δiC，這些都是SPPCL-b-PEO的特征峰，而屬于 SPPCL的端基碳信號δgC(δ60.1)完全消失了。SPPCL-b-PEO 的 Mn，NMR與 Mn，th基本一致，具體值見表1。這些說明該反應有效合成了SPPCL-b-PEO。

圖5是聚合物SPPCL、CMPEO及共聚物SPPCL-b-PEO的FT-IR圖譜，可觀察到在1 734 cm－1和2 952 cm－1處分別出現了PCL的羰基(C==O)伸縮振動峰和甲基(—CH3)/亞甲基(—CH2—)伸縮振動峰。位于1 104 cm－1和2 882 cm－1處的信號峰分別歸屬于PEO中的醚鍵(O—C—O)和亞甲基(—CH2—)。此外，隨著PEO嵌段的接入及長度的增加，羰基和甲基/亞甲基的峰信號逐漸減弱。

圖3 SPPCL(1)和 SPPCL-b-PEO(2)在 CDCl3中的1H NMR圖譜Fig 3 1H NMR spectra of SPPCL(1)and SPPCL-b-PEO(2)in CDCl3

圖4 SPPCL(1)和 SPPCL-b-PEO(2)在 CDCl3中的13C NMR圖譜Fig 4 13C NMR spectra of SPPCL(1)and SPPCL-b-PEO(2)

圖5 SPPCL，CMPEO和SPPCL-b-PEO的FT-IR圖譜Fig 5 FT-IR spectra of SPPCL，CMPEO and SPPCL-b-PEO

圖6是THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000在DMSO中和SPPCL24-PEO5000納米微球在H2O中的UV-vis圖譜，均在435 nm處出現B(soret)吸收和Q(500～700 nm)帶吸收，這些都屬于卟啉化合物典型的紫外吸收［10，20］。這表明 SPPCL 和 SPPCL-b-PEO仍然保留了卟啉的發光性能。這一潛在性能使SPPCL和SPPCL-b-PEO可作為生物探針和PDT光敏劑被應用。

圖 6 THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5 000在 DMSO中和SPPCL24-PEO5 000納米微球在H2O中的UV-vis譜圖Fig 6 UV-vis spectra of THPPH2，SPPCL24，SPPCL24-PEO5 000in DMSO and SPPCL24-PEO5 000 nanospheres in H2O

2.2 大分子骨架對卟啉核的屏蔽效應

利用熒光探針法分別對THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000接受光照后的淬滅程度進行了研究，DPBF由于具有較強的熒光活性被用作試驗的熒光探針［13－15］。卟啉類化合物能在特定波長激光照射下，受到激發而產生能量，能量傳遞給周圍的氧，生成活性很強的單態氧。活性氧對熒光具有淬滅作用。因此，混合溶液系統在接受特定波長激光照射過程中，DPBF產生的熒光被卟啉產生的單態氧淬滅，導致DPBF熒光強度下降。如圖7所示，相同光照時間內，加入含等量卟啉核的 THPPH2、SPPCL24、SPPCL24-PEO5000樣品后的混合溶液系統的熒光強度均減弱了，但變化程度(ΔI)卻有明顯的差別，ΔITHPPH2＞ΔISPPCL24＞ΔISPPCL24-PEO5000。這證明了大分子骨架對卟啉核具有保護作用，使其在光照下緩慢持續地釋放單態氧。這對于提高藥物在腫瘤組織中的保留時間，達到持久療效具有重要的臨床意義，并且克服了小分子卟啉在體內易分散的缺點，從而降低對正常組織的毒性。

2.3 SPPCL-b-PEO共聚物自組裝行為

圖8是SPPCL-b-PEO共聚物膠束的TEM照片，可以明顯觀察到隨著共聚物中親水PEO鏈段質量分數的減小，共聚物自組裝膠束的形態由球狀逐漸轉變為蠕蟲狀。SPPCL24-PEO5000(fPEO=69.2%)自組裝形成了大小均一，尺寸大約50 nm的球狀膠束;SPPCL24-PEO2000(fPEO=44.2%)形成了蠕蟲狀膠束，這種特殊的形態是由于共聚物中PEO的質量分數降低，膠束親水表面中PEO鏈間斥力減少及表面張力增加，從而影響了系統親-疏平衡而導致膠束形貌的改變。

圖7 含THPPH2、SPPCL24和SPPCL24-PEO5000的混合樣品溶液中DPBF的熒光激發光譜(1～3)及熒光強度在不同光照時間下的變化曲線(4)Fig 7 Fluorescence excitation spectra(1－3)and dynamic curve(4)of fluorescence intensities under different illumination timeof DPBF solutions in DMF respectively including THPPH2，SPPCL24，SPPCL24-PEO5000

圖8 SPPCL-b-PEO共聚物的透射電鏡照片Fig 8 TEM photographs of SPPCL-b-PEO copolymers

2.4 藥物的負載與體外釋放

多柔比星是一種廣泛應用于臨床的抗癌藥物，在負載多柔比星的SPPCL24-PEO5000納米微球的制備中，TEA用于中和鹽酸多柔比星中的鹽酸，使其變為疏水多柔比星，易與共聚物納米微球的親水表面相互作用，有利于負載。多柔比星的pKa=8.4，所以多柔比星在 pH 8.4的PBS溶液中可以得到13.8%的載藥量和80.8%的包封率。

負載多柔比星的載藥納米微球的體外釋放具有pH敏感應。這是因為多柔比星在堿性環境中是以疏水性游離分子態存在，而在酸性環境中則處于水溶性的離子態。圖9為該載藥微球在pH 7.4和pH 5.6的PBS體系中的累積釋放曲線。可以看出，在釋放的前10 h，兩者都存在突釋;10 h以后，釋放曲線趨于平緩，藥物在介質中緩慢釋放。但是多柔比星在兩種pH環境中的釋放量有明顯差別。在pH 7.4的介質中，12 h內釋放了20.8%，96 h的累積釋放量僅為39.9%。而在pH 5.6的介質中釋放速率明顯增大，12 h的釋藥量為43.2%，96 h已達到了73.4%。機體正常組織的pH值為7.4左右，而腫瘤組織的pH值為5～6。所以該納米載藥系統的釋藥特性有利于靶向于腫瘤細胞。

圖9 37℃下負載多柔比星的SPPCL24-PEO5000納米微球在pH7.4和5.6的PBS體系中的藥物釋放曲線Fig 9 Doxorubicin release curve of SPPCL24-PEO5000nanospheres in PBS solutions of pH7.4 and 5.6 at 37℃

3 討論

本實驗通過開環聚合和酯化反應，成功合成了一系列以卟啉為核的星型兩親性SPPCL-b-PEO共聚物。該共聚物不僅具有兩親性骨架，可在水中自組裝形成膠束，還具有卟啉內核，具有良好的光敏性和腫瘤組織的靶向性，且大分子PCL-PEO骨架能有效阻止卟啉核的自淬滅。此外，以該共聚物作為載體的負載多柔比星的納米微球，有較高的包封率和載藥量。實驗還發現載藥納米微球的釋放具有pH敏感性，在酸性環境中能夠快速大量釋放藥物，而在堿性環境中絕大多數藥物仍然保留于載體中，有利于靶向腫瘤細胞。由于被載藥物可選擇性地在腫瘤細胞中釋放，而對正常組織影響較小，負載多柔比星的SPPCL-b-PEO共聚物納米微球符合抗腫瘤靶向給藥系統的要求。

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