鹽酸表柔比星長循環磁性脂質體的制備及表征

方瑜，陳進，吳詢燊，吳修艮，姜德立，陳敏，謝吉民

(1.江蘇大學化學化工學院，江蘇 鎮江 212013;2.江蘇吉貝爾藥業有限公司，江蘇 鎮江 212009)

鹽酸表柔比星(EPI)是一種廣譜的蒽環類化療藥物，抗癌譜廣，療效顯著，可治療多種腫瘤。但該藥嚴重的毒副作用，尤其是嚴重的心臟損害、骨髓抑制等不良反應限制了其臨床應用［1］。脂質體是將藥物包封于類脂質雙分子層內而形成的微型泡囊，可以有效保護被包裹藥物、提高藥物的治療指數、減少藥物的治療劑量、降低藥物的毒副作用、減輕變態反應及免疫反應并延緩藥物釋放［2－3］。研究結果表明，脂質體包裹EPI的毒性比游離藥物的毒性降低50% ～70%［4］。磁性脂質體是近年來國內外大力研究的一種新型靶向制劑，這種制劑可使藥物同時具有生物功能、磁靶向功能和治療功能，因此具有更大的應用前景［5－8］。但是目前的磁性脂質體大多存在著許多不可避免的缺點，例如體內循環時間短，物理和化學穩定性不足，囊泡表面缺少靶向位點及水溶液中分散性不好等，因此開發一種具有優良性能的磁性脂質體勢在必行。

本研究以聚乙二醇單甲醚(mPEG)為修飾膜材，采用乙醇注入－硫酸銨梯度法制備mPEG化EPI磁性脂質體，并對其進行表征;采用葡聚糖凝膠柱－紫外法測定脂質體中EPI的包封率，并考察制備條件對EPI包封率的影響，得到最佳制備條件;進一步研究該脂質體的穩定性和緩釋效果。旨在為EPI系列新制劑的開發應用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乙二醇單甲醚(mPEG)(阿拉丁試劑公司);膽固醇(生工生物工程有限公司);卵磷脂(國藥集團化學試劑有限公司);注射用鹽酸表柔比星(浙江海正藥業有限公司);氯化鐵、氯化亞鐵、氯仿、異丙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫酸銨均購于國藥集團化學試劑有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-52C旋轉蒸發器(鞏義市英峪予華儀器廠);電動攪拌器JJ-1(江蘇金壇醫療儀器廠);氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫療器械廠);Nexus 470 FT-IR光譜儀(美國Nicolet公司);Philips Tecnai-12透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司);UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4納米顆粒的制備和表征 在攪拌條件下，將0.5 g氯化鐵和0.17 g氯化亞鐵加入150 mL除氧的蒸餾水中，緩慢滴入2 mol/L的氨水，待反應物變為黑色后，調節pH為9～10，在氮氣保護下80℃回流2 h。反應結束后，蒸餾水洗滌2～3次，最終產物分散于無水乙醇中。

采用透射電鏡(TEM)觀察所制得Fe3O4納米顆粒的形貌和粒徑。

1.2.2 mPEG化EPI納米磁性脂質體的制備和表征 按比例稱量卵磷脂、膽固醇、mPEG和Fe3O4，超聲溶于15 mL無水乙醇，用1 mL注射器將混合液緩慢注入裝有25 mL硫酸銨溶液的圓底燒瓶中，水浴超聲30 min，減壓旋轉蒸發，直至無明顯乙醇味，制得空白脂質體。將空白脂質體裝入透析袋中，用PBS溶液透析24 h。透析后的空白脂質體中加入一定量預熱過的 EPI溶液，置于55℃水浴孵化30 min，用兩層微孔濾膜(超強型，上海密粒膜分離技術有限公司)過濾，控制脂質體大小，并濾去未包封住的顆粒，即得磁性EPI脂質體，4℃保存。

采用透射電鏡觀察所制得磁性EPI脂質體的形貌和粒徑;通過外加磁場的作用，考察所制得磁性EPI脂質體的體外磁響應性;通過紅外光譜分析，研究mPEG對所制得的磁性EPI脂質體的修飾效果。

1.2.3 mPEG化EPI納米磁性脂質體中EPI包封率的測定

1.2.3.1 回歸方程 稱取EPI標準品適量，以PBS為溶劑配置0.2 mg·mL－1的儲備液，分別配成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg·mL－1的 EPI 標準溶液，在最高吸收波長(232 nm)下測定光密度(D)值，將D值與質量濃度(C)進行線性回歸，得到回歸方程和相關系數。

1.2.3.2 包封率的測定 取1 mL mPEG化EPI納米磁性脂質體混懸液加到葡聚糖 G-50凝膠柱上，用PBS溶液以1 mL·min－1的流速洗脫，于最高吸收波長處進行紫外光譜檢測，根據結果繪制洗脫曲線。

收集形成洗脫曲線的第1峰的洗脫液，得到除去游離EPI的含藥脂質體溶液，加入異丙醇-鹽酸(V∶V=9∶1)混合液使脂質體完全破裂，用紫外分光光度計于最高吸收波長處測定光密度，按照葡聚糖凝膠柱-紫外法(Sephadex-UV)測定mPEG化磁性EPI納米脂質體的包封率。包封率的計算公式如下:

其中E為包封率，C1為1 mL樣品中EPI包封量，C2為1 mL樣品中EPI總量。

1.2.4 體外穩定性和緩釋效果試驗 測定所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質體樣品中EPI的包封量C1后，將樣品置于37℃氣浴恒溫振蕩器中，振蕩速度 100 r·min－1，分別于 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h取樣1 mL，測定脂質體內EPI的包封量C2。按下列公式計算EPI釋放率(R):

根據EPI釋放率的變化情況，評價所制得EPI長循環脂質體的體外穩定性和緩釋效果。

2 結果與討論

2.1 納米Fe3O4形貌和粒徑

圖1為所制備的Fe3O4納米粒子的TEM照片。由圖1可見，產物Fe3O4納米粒子為近球形顆粒，平均粒徑約為20 nm，粒度均勻性良好，無明顯團聚現象。

圖1 Fe3O4納米粒子的TEM照片Fig 1 TEM micrograph of Fe3O4nanoparticles

2.2 mPEG化EPI納米磁性脂質體形貌和粒徑

取適量脂質體，以PBS稀釋至較低濃度，超聲分散均勻，滴于銅網上，以質量分數為2%的磷鎢酸負染，透射電鏡下觀察產物形貌。圖2為所制備的EPI磁性脂質體的透射電鏡照片，可以明顯看出，所制得的mPEG修飾EPI磁性脂質體粒徑約50 nm，近球形;Fe3O4粒子被包覆于脂質體膜內，包覆的磁性顆粒的尺寸大于未被包覆的Fe3O4納米顆粒，可能是由于Fe3O4粒子團聚所致。

圖2 mPEG化EPI納米磁性脂質體的TEM照片Fig 2 TEM micrograph of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.3 mPEG化EPI納米磁性脂質體體外磁響應性

實驗結果見圖3。原本均勻分散在PBS溶液中的磁性脂質體(圖3a)在3 min內迅速聚集在磁鐵一側(圖3b)，表明所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質體具有良好的磁響應性。

圖3 mPEG化EPI納米磁性脂質體被外磁場吸引Fig 3 The photo of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes in vitro magnetic induction

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜圖見圖4。經對比，c中3 400 cm－1左右的寬扁峰是羥基的伸縮振動峰，2 900 cm－1左右的峰對應mPEG的—CH2CH2O—單元中的亞甲基碳氫吸收峰，1 750 cm－1處的中等強度吸收峰是羰基的振動吸收峰，1 100 cm－1代表C—O醚鍵的伸縮振動，可以初步表明形成了mPEG化EPI納米磁性脂質體。

圖4 mPEG化EPI納米磁性脂質體的紅外譜圖Fig 4 Fourier transform infrared(FTIR)absorption spectra of mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.5 mPEG化EPI納米磁性脂質體的包封率

采用葡聚糖凝膠柱-紫外法測定脂質體中EPI的包封率。由實驗得到EPI的回歸方程為 A=8.659 26C+0.055 87，r2=0.999 4。

圖5為游離EPI和mPEG化EPI納米磁性脂質體的洗脫曲線。由于游離EPI微粒本身直徑小，易分散在葡聚糖凝膠間隙，因此過柱時間長;而mPEG化EPI納米磁性脂質體微粒直徑較大，過柱時間短，先被洗脫，這樣就實現了兩者較好的分離。曲線中第1個波峰對應先洗脫下來mPEG化EPI納米磁性脂質體的量，而第2個波峰對應后洗脫下來游離EPI的量。從洗脫曲線中可以看出，游離EPI的洗脫體積為100～130 mL，而mPEG化EPI納米磁性脂質體的洗脫體積為8～12 mL，說明凝膠柱可確保脂質體和游離EPI的完全分離，且無柱吸附現象。

圖5 游離EPI和mPEG化EPI納米磁性脂質體的洗脫曲線Fig 5 Elution curve of the free EPI and mPEG modified magnetic long-circulating EPI liposomes

2.6 影響EPI包封率的因素

2.6.1 水浴孵化時間對包封率的影響 孵化時間對mPEG化EPI磁性脂質體包封率的影響見圖6。制備條件:溶劑為無水乙醇(15 mL);m(卵磷脂):m(膽固醇)=5∶1;m(EPI)=0.55 mg;m(mPEG)=0.02 g。

圖6 水浴孵化時間對包封率的影響Fig 6 Effects of incubation time in water bath on encapsulation efficiency of EPI

圖6表明，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率先隨水浴孵化時間的增長而提高，當孵化時間為30 min時，EPI脂質體的包封率達到最大值57.5%，再繼續增長水浴孵化時間，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率基本保持不變。

2.6.2 卵磷脂與膽固醇質量比對包封率的影響卵磷脂與膽固醇質量比對包封率的影響如圖7所示。制備條件:溶劑為無水乙醇(15 mL);m(EPI)=0.55 mg;m(mPEG)=0.02 g;t=30 min。

圖7 卵磷脂與膽固醇質量比對包封率的影響Fig 7 Effects of mass ratio of lecithin to cholesterol on encapsulation efficiency of EPI

圖7顯示，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率先隨卵磷脂質量比的增加而提高，當m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1時，EPI脂質體的包封率達到最大值57.5%，再繼續增加卵磷脂用量，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率反而降低。這可能是由于膽固醇是脂質體膜的一種收緊劑，當卵磷脂與膽固醇的比例合適時，脂質體膜會比較致密，內水相中的藥物才能不滲漏出來。當卵磷脂用量過大時，膽固醇無法使其充分形成穩定致密的磷脂膜，反而降低了包封率。

2.6.3 EPI用量對包封率的影響 圖8為EPI用量對包封率的影響。制備條件:溶劑為無水乙醇(15 mL);m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1;m(mPEG)=0.02 g;t=30 min。從圖8可以看出，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率先隨EPI用量的增加而提高，當EPI用量為0.55 mg時，EPI脂質體的包封率達到最大值57.5%，再繼續增加EPI用量，EPI脂質體的包封率反而降低。這可能是由于EPI溶液呈弱堿性，大量的EPI溶液降低了原本的硫酸銨梯度，隨著內外水相的硫酸銨梯度減小，產生的pH梯度和驅動力越小，EPI進入內水相的量也越小，包封率越低。

圖8 EPI用量對包封率的影響Fig 8 Effects of EPI dosage on encapsulation efficiency of EPI

2.6.4 mPEG用量對包封率的影響 mPEG用量對EPI磁性脂質體包封率的影響見圖9。制備條件:溶劑為無水乙醇(15 mL);m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5 ∶1;m(EPI)=0.55 mg;t=30 min。

圖9 mPEG用量對包封率的影響Fig 9 Effects of mPEG amount on encapsulation efficiency of EPI

圖9顯示，所制得脂質體的包封率先隨mPEG用量的增加而提高，當 mPEG用量為0.02 g時，mPEG化EPI磁性脂質體的包封率達到最大值57.5%，再繼續增加EPI用量，脂質體的包封率降低。這是由于mPEG具有疏水性長鏈，能插入脂質體膜，而親水端伸展于脂質體的表面，由于這種物質本身的成膜性差，在脂質體膜中所占的比例過大時，會破壞脂質體膜的穩定性，從而降低脂質體對水溶性物質的包封率。

2.6.5 不同溶劑對包封率的影響 為觀察不同溶劑對mPEG化EPI磁性脂質體包封率的影響，我們分別使用氯仿、二氯甲烷、無水乙醇和乙醚作為溶劑，制備條件:m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5∶1;m(EPI)=0.55 mg;t=30 min;溶劑15 mL。結果氯仿、二氯甲烷、無水乙醇和乙醚作為溶劑，mPEG化EPI磁性脂質體包封率分別為52.3%，46.5%，57.5%和24.1%。

可見無水乙醇作溶劑時包封率最好，可達到57.5%，同時，無水乙醇與其他溶劑相比，無毒，低廉。因此本實驗選擇無水乙醇作為溶劑。

2.7 mPEG化EPI納米磁性脂質體的緩釋效果

圖10為mPEG化EPI納米磁性脂質體的體外釋放曲線，可以看出，EPI藥物在0.5 h的釋藥率即達到了24.8%，1 h后釋藥率達到44.8%，2 h的釋藥率為60.3%。隨后，mPEG化EPI納米磁性脂質體的釋藥率緩慢減慢，4 h后維持在55.0%左右。以上實驗結果表明所制備的mPEG化EPI納米磁性脂質體具有優良的緩釋效果。

本實驗采用PBS溶液作為釋放介質，考察了mPEG化EPI納米磁性脂質體的緩釋效果，因為PBS(pH=7.4)液與血液pH值相同。以上結果同時表明，mPEG化EPI納米磁性脂質體在PBS液具有良好的緩釋效果，但其血漿釋放度和藥物代謝動力學及生物利用度有待進一步研究。

圖10 mPEG化EPI納米磁性脂質體的體外釋放曲線Fig 10 Release profiles of EPI at pH 7.4 in PBS solution

3 結論

磁性長循環納米脂質體與其他納米磁性藥物載體相比，盡管制備較復雜，成本較高，但對藥物具有高包封和明顯的長效緩釋效果［9－10］。而且與其他抗癌藥物制劑相比，應用脂質體包裹化療藥物后，能顯著減輕藥物的毒副作用，提高化療藥物的療效指數，且脂質體為納米生物膜，毒性低，與人體組織細胞有很好的生物相容性。

本研究以沉淀法制備納米磁性Fe3O4為磁核，聚乙二醇單甲醚(mPEG)為修飾劑，采用乙醇注入法制備空白mPEG化磁性脂質體，硫酸銨梯度法包覆EPI，制備了mPEG化EPI納米磁性長循環脂質體。實驗結果表明，當以無水乙醇為溶劑(15 mL)，m(卵磷脂)∶m(膽固醇)=5 ∶1，m(EPI)=0.55 mg，m(mPEG)=0.02 g時，制備的mPEG化EPI納米磁性脂質體體顆粒為近球形，平均粒徑約為50 nm，藥物包封率達到57.5%，磁響應性和緩釋效果均良好。作為一種新型藥物制劑，隨著科學技術的發展，納米磁性長循環脂質體必將會有廣闊的發展前景。

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