熒光PCR及培養法檢測解脲支原體結果對比分析

潘春燕 蔡朝民 謝春英 王燮衡

解脲支原體（Ureaplasma Urealyticum,UU）是條件致病菌，當機體免疫力下降、菌群失調、長期使用抗生素時能迅速繁殖，其黏附在泌尿道上皮細胞表面[1-2]。UU常引起非淋菌性陰道炎，UU感染還可導致不育、早產、慢性前列腺炎等[3]。臨床對UU的確診主要依靠實驗診斷，實驗室對UU的檢查方法主要有熒光PCR、培養、酶鏈免疫試驗等。熒光PCR技術采用一對PCR引物和一個熒光雙標記的探針，該探針能與引物擴增區域中間的一段模板發生特異性結合，從而將PCR技術和熒光檢測技術結合起來，實現了對UU核酸的自動化檢測。培養法不需要特殊設備，操作簡單，同時還可以做藥敏試驗，目前臨床上普遍使用此法來檢測解脲支原體。隨著分子生物學的發展，熒光PCR技術在檢測病原體方面得到越來越廣泛的應用。本文通過收集856 例樣本，分別采用熒光PCR和培養法檢測解脲支原體，對檢測結果進行分析比較，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 856 例患者均為2010年1月-2012年1月廣東省深圳市寶安區人民醫院接診的女性病例，年齡18～57歲。

1.2 試劑 熒光PCR UU檢測試劑盒由深圳匹基公司提供，UU液體培養基由珠海銀科生物技術應用研究所提供。

1.3 儀器 ABI Gene Amp 7700 熒光PCR擴增儀(美國ABI公司)、高速低溫離心機（Sigma公司）、干式恒溫器（ 杭州藍焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）、恒溫培養箱（上海精宏實驗有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 標本的采集 所有患者均用窺陰器暴露宮頸后，先用棉拭子擦去宮頸口過多的黏液，再用另一根棉拭子插入宮頸管內1～2 cm處，停留10～30 s后緩慢旋轉1 周，取出分別置于兩根無菌試管內待檢。

1.4.2 培養方法及結果判定 將待檢拭子在取出后半小時內接種于UU培養液中，置于37℃ 5%～10% CO2和90%～95% N2環境中，每天觀察結果，培養24～48 h后液體培養基從淡黃色→淡紅色→紅色，且澄清無明顯沉淀者即為UU生長，結果陽性；不變色者為陰性；變紅色且渾濁者為細菌污染。

1.4.3 熒光PCR法檢測UU DNA

1.4.3.1 UU DNA模板制備 取待測樣本及陰、陽性對照品（試劑盒備有）各100 uL,分別加入到0.5 mL的離心管中，再分別加入100 uL DNA提取液1，震蕩混勻，13000 rpm離心10 min；吸棄上清液，再加入50 ul提取液2，震蕩混勻，100℃干浴10 min；冷至室溫后,13000 rpm離心10 min,保留上清液備用。

1.4.3.2 PCR擴增 從試劑盒中取出UU DNA擴增反應液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規定比例混合均勻，根據試劑盒說明書配制反應液，分裝于PCR反應管中，每次實驗均設1 管陰性對照，1 管陽性對照，將上述對照及標本各加2 uL于加好反應液的PCR反應管中，上機擴增。擴增條件設置為37℃：5 min； 94℃：1 min；95℃：5 sec； 60℃:30 sec；再進入40 個循環，反映體系設為40 uL。熒光信號收集時設定為Fam熒光素。

1.4.3.3 結果分析條件設定 取3-10 或3-15 個循環的熒光信號，閾值選定為剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值=40.0 為準。

1.4.3.4 質控標準 陰性對照的Ct值均應等于40.0，陽性對照的Ct值應小于等于30.0。

1.4.3.5 結果判斷 Ct值等于40 或0 的樣本為陰性標本；檢測樣本Ct值≤37.0 者判為陽性；Ct值＞37.0 的樣本重做，重做結果Ct值＜40 為陽性，否則為陰性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

熒光PCR法檢測856 例樣本中的解脲支原體，351 例陽性，陽性率達41.0%，351 例熒光PCR法檢測陽性的樣本中有67 例培養法檢測陰性；培養法檢測856 例樣本，289 例陽性，陽性率達33.7%，其中5 例培養法檢測陽性的樣本熒光定量PCR法檢測為陰性；兩種方法檢測均陽性284 例。熒光PCR的陽性檢出率明顯高于培養法（P<0.05）,結果見表1。對67 例熒光PCR檢測陽性而培養法檢測陰性病例進行病史及用藥史追蹤。

表1 熒光PCR和培養法UU檢測結果比較

3 討論

UU是一群大小介于細菌與病毒之間的病原體，臨床對UU的確診主要依靠實驗診斷。熒光PCR技術敏感、快速，目前已常規的應用到臨床一些病原體的檢測中，該技術把目的基因擴增、特異分子雜交和熒光探針定量PCR技術融為一體，PCR擴增和產物分析的全過程均在單管封閉的條件下進行，并通過微機控制，實現了對擴增產物進行實時動態檢測和結果的自動分析[4]。培養法檢測UU，主要是利用UU可產生脲素酶分解尿素引起培養基變色的原理，根據指示劑是否變色來判斷結果的陰陽性。本文收集了856 例宮頸分泌物樣本，分別用熒光PCR技術和培養法檢測解脲支原體，對檢測結果進行比較分析。

熒光PCR法檢測856 例樣本，351 例陽性，陽性率達41.0%，351 例熒光PCR法檢測陽性樣本中67 例培養法檢測呈陰性，造成這種差異的原因主要有：（1）熒光PCR技術敏感度比培養法高,熒光PCR是采用體外擴增的方法，理論上只要存在病原體DNA即可檢出；（2）標本的采集及標本擱置的時間影響到檢測結果，培養法必須有一定存活的病原體存在才可檢出，標本擱置時間過長易導致培養法檢測結果的假陰性，而熒光PCR法檢測則無需活的病原體存在，對死亡一段時間內的病原體DNA仍可檢出；（3）污染造成檢測結果的假陽性。培養法檢測856 例樣本，289 例陽性，陽性率達33.7%，其中5 例培養法檢測陽性樣本熒光定量PCR檢測為陰性，出現這種情況的原因我們認為主要有：（1）標本中存在抑制Taq酶的因子；（2）模板提取缺失，未能提取到目的模板；（3）基因變異，UU變異后仍保留其分解尿素的特性，此時培養法檢測結果為陽性，而熒光PCR技術中引物設計是針對靶序列基因保守區的，未能檢出其變異基因[5]。

從檢測結果看，兩種方法的陽性檢出率有明顯差異（P<0.05），熒光PCR的陽性檢出率明顯高于培養法。我們對67例熒光PCR檢測陽性而培養法檢測陰性病例進行病史和用藥史追蹤，發現有27 例患者在初診確認為UU感染，經藥物治療臨床癥狀已基本消失，此時患者的宮頸分泌物樣本用培養法檢測為陰性，而熒光PCR檢測仍為陽性。我們認為患者支原體感染后的用藥監測，采用培養法檢測病原體，結果更為客觀，這與陳春英等的結論基本一致[6]。對于初診，且尚未使用藥物的患者，以及對UU的流行病學調查研究可采用熒光PCR法，由于熒光PCR檢測結果無法反映UU的存活狀況，因此不適合用于藥物監測。在UU檢測的方法學選擇上，我們認為可以根據不同目的來選擇，結合熒光PCR及培養法，更能提高UU的檢測水平。

[1]劉小敏，李海燕，楊美玲，等.泌道生殖道支原體、衣原體及藥敏試驗檢測及藥敏結果探討[J].中外醫學研究，2012（12）44-45.

[2]周鐵明，劉佩.泌尿生殖道分泌物支原體培養及藥敏結果分析[J].國際檢驗醫學雜志，2011,32（3）：410-411.

[3]馬新茹.女性泌尿生殖道炎癥患者支原體感染現狀及其抗生素的敏感性研究[J].實驗預防醫學，2012（3）:733-734.

[4]Fahle GA，Parker JM，Fischer SH，et al.Rapid and sensitive detection of cytomegalovirus using PCR and the DELFIA-time-resolved fluorescence hybridization assay[J].Abstr Gen Meet AM Soc Microbiol,1997,4(8):153.

[5]陳春英，楊舒盈，朱根海.女性生殖道感染治療前后解脲支原體熒光定量PCR檢測的假陽性分析[J].中國優生與遺傳，2007，15（3）：32.

[6]時宇花，韋玉瑩.女性泌尿生殖道炎癥患者解脲支原體、人型支原體和沙眼衣原體感染檢測及藥敏分析[J].廣西醫學，2013，35（2）：229-230.