不同部位靈芝及子實體提取物中總三萜酸含量測定

馮慧琴，楊明俊，楊曉彤，楊慶堯

（1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；2.上海芝草生物技術有限公司，上海 200234）

不同部位靈芝及子實體提取物中總三萜酸含量測定

馮慧琴1，楊明俊1，楊曉彤1，楊慶堯2*

（1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海200234；2.上海芝草生物技術有限公司，上海 200234）

建立不同部位靈芝及子實體提取物中總三萜酸含量測定方法.靈芝樣品用乙醇提取，依次經氯仿、5%碳酸氫鈉萃取，酸化后再用氯仿萃取、濃縮至干，稱重，即得靈芝總三萜酸量.結果：靈芝子實體總三萜酸為（8.58±0.25）mg／g，孢子粉為（3.48±0.03）mg／g，菌絲體僅為（1.75±0.09）mg／g；菌蓋總三萜酸含量為（12.62±0.22）mg／g，菌柄為（7.66±0.08）mg／g. 10批次靈芝子實體的總三萜酸含量范圍為4.34～16.39 mg／g.靈芝子實體提取物中的總三萜酸含量以醇-水提取物的最高為（208.70±5.54）mg／g；堿水提取物的最低，僅為（123.07± 4.99）mg／g.HPLC初步分析子實體和孢子及子實體提取物間三萜酸成分大部分相同.本法適用于靈芝子實體及其提取物、靈芝孢子和菌絲體總三萜酸的含量測定，結果可靠，可為靈芝產品質量指標提供依據.

靈芝；總三萜酸；子實體；孢子；菌絲體；提取物

靈芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.）Karst是我國著名的藥用真菌，其中三萜化合物是靈芝的主要活性成分，據報導從靈芝子實體、孢子及菌絲體中分離的三萜化合物已約160種［1-5］，它們具有抑制腫瘤、保護肝臟、抗氧化、免疫調節、抑制膽固醇合成、抗菌、抗炎、抗病毒等廣泛的藥理活性［ 2，6-7］，因此三萜化合物的含量是靈芝產品品質鑒定的重要指標.用HPLC方法定量分析靈芝三萜酸成分，丁平［8］測定了靈芝不同部位中靈芝酸B的含量，馬林［9］測定靈芝中孢子酸A、赤芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C的含量，馬利金［10］分析紅芝中靈芝酸A～C 3種成分的含量.本實驗參照Tsuyoshi Nishitoba［11］分離靈芝酸和赤芝酸方法，測定了不同部位靈芝及子實體提取物的總三萜酸含量，而非三萜酸中某一或幾個成分.

1 材料與方法

1.1材 料

靈芝子實體(GL-F）和孢子(GL-S）產自金寨；另10批靈芝子實體市購；靈芝菌絲體：液體培養，本所提供；靈芝水提取物(GL-WW）；靈芝水醇提取物(GL-WA）；靈芝醇水提取物(GL-AW）；靈芝堿水提取物(GL-LW），本所提供；氯仿、碳酸氫鈉、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸均為國產分析純.

1.2 靈芝總三萜酸的制備

取靈芝子實體粉末或孢子或菌絲體10g，或靈芝子實體提取物2g，精確稱重，加100 mL水超聲5min，加95%乙醇100 mL，30℃磁力攪拌30 min，過濾，獲醇提取液1；殘渣加200 mL 50%乙醇，30℃磁力攪拌30 min，過濾，得醇提取液 2，合并醇提取液1、2并濃縮，濃縮液加50 mL氯仿萃取，重復3次，氯仿萃取液中加50ml5%NaHCO3萃取，重復3次，NaHCO3液用2mol／LHCl調pH至 3，在酸性溶液中加氯仿50 mL進行萃取，重復3次，酸性氯仿萃取液合并濃縮至干，放置干燥器內24 h，即得靈芝總三萜酸，精確稱重，計算：靈芝總三萜酸含量＝靈芝總三萜化酸重量(mg）／樣品重量(g）.

1.3 靈芝總三萜酸的HPLC條件

采用Bechman System Gold高效液相色譜系統，包括125液相泵和168 DAD檢測器.色譜柱：Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：2%乙酸∶乙腈＝2∶1；流速：1.0 mL／min；檢測波長：252 nm；進樣體積：20μL；柱溫：27℃.

2 結 果

2.1 靈芝不同部位的總三萜酸含量比較

分別取靈芝子實體(GL-F）、孢子(GL-S）、液體培養菌絲體(GL-M）、子實體中的菌蓋(GL-P）和菌柄(GL-ST），粉碎后按1.2方法制備，計算靈芝總三萜酸含量.結果顯示GL-F含總三萜酸(8.58±0.25）mg／g，GL-S的總三萜酸含量為(3.48±0.03）mg／g，而GL-M的總三萜酸含量最少，僅有(1.75±0.09）mg／g(圖1）.經t檢驗，GL-F、GL-S、GLM三者兩兩比較差異達極顯著水平(p＜0.01）.GL-P總三萜酸含量為(12.62±0.22）mg／g，GL-ST的含量為(7.66± 0.08）mg／g(圖1），t檢驗兩者差異極顯著(p＜0.01）.

表1 市售10批靈芝子實體總三萜酸含量比較

2.2 市售靈芝子實體總三萜酸含量比較

將市售10批靈芝子實體分別粉碎后按1.2方法制備，計算靈芝總三萜酸含量.結果表明10批靈芝子實體中總三萜酸含量最高達(16.39±0.58）mg／g，最低僅為(4.34±0.21）mg／g；有4批靈芝總三萜酸含量高于10 mg／g，3批次的含量卻低于5 mg／g，不同靈芝子實體的總三萜酸含量差異大(表1）.

2.3 子實體提取物中靈芝總三萜酸含量的比較

將各提取物按1.2方法制備，計算靈芝三萜酸含量.結果由高至低如下：GL-AW∶(208.70±5.54），GL-WA∶(184.46± 3.75）mg／g，GL-WW∶(134.42±5.85）mg／g，GL-CW∶(123.07 ±4.99）mg／g.t檢驗，GL-AW和GL-WA兩者總三萜酸差異顯著(p＜0.05）；而GL-WW和GL-CW總三萜酸含量無統計差異(p＞0.05），但兩者分別與GL-WA或GLAW比較總三萜酸含量均差異極顯著(p＜0.01）.

靈芝子實體提取物所含的靈芝總三萜酸含量因提取方法不同而異，但總三萜酸含量均遠高于未經提取的靈芝子實體(GL-F）中的含量，GL-F的總三萜酸為(12.62±0.22）mg／g，其提取物總三萜酸含量則是它的9～16倍(圖2）.

2.4 靈芝總三萜酸的HPLC的初步分析

HPLC圖譜峰顯示，靈芝子實體和孢子有23個共有峰，兩者所含的三萜酸74%的成分相同，而菌絲體的三萜酸的成分較前兩者差異大(表2、圖3）.以GL-F序號7峰的峰面積為參照，計算各峰的相對峰面積，從相對峰面積中可推斷子實體的總三萜酸含量明顯高于孢子和菌絲體(表2）.

圖2 不同靈芝子實體提取物中總三萜酸含量比較

圖3 靈芝子實體、孢子粉、菌絲體的HPLC圖譜

表2 靈芝子實體、孢子和菌絲體HPLC圖譜峰的保留時間和相對峰面積

HPLC圖譜分析結果表明4種子實體提取物間有25個共有峰(表3、圖4），它們的總三萜酸成分相同部分近80%；以GL-CW的序號8的峰面積為參照，計算各峰的相對峰面積，從中可認定AW總三萜酸含量最高，CW最低(表3）.

3 討 論

靈芝不同部位其靈芝總三萜酸含量不同.馬林等［9］檢測了靈芝子實體、孢子粉、發酵菌絲體中靈芝酸B及C、赤芝酸A和赤芝孢子酸A 4種三萜酸含量，結果子實體占最多，其次為孢子粉，菌絲體最少，只檢出靈芝酸B；丁平［8］測定的不同部位靈芝酸B含量順序為菌蓋表皮＞菌蓋子實體＞菌柄＞木栓層＞孢子粉，菌絲體未檢出；本實驗不同部位靈芝中總三萜酸含量與前述文獻有相似結果，菌蓋、子實體、菌柄、孢子粉、菌絲體的靈芝總三萜酸含量依次遞減，且菌絲體的三萜酸成分比子實體和孢子的少很多.

實驗中子實體提取物的總三萜酸含量遠遠高于子實體，提取物中GL-AW和GL-WA的總三萜酸含量明顯超過GL-WW和GL-CW，用乙醇做溶劑提取靈芝子實體，可大大提高靈芝產品中的總三萜酸含量，提升產品質量.

按照1.4方法測定靈芝總三萜酸含量，6次重復實驗RSD為4.38%，重現性好.本法適用于靈芝子

實體、孢子、菌絲體和子實體提取物的總三萜酸含量測定，結果可靠，可為靈芝產品質量指標提供依據.

表3 靈芝子實體提取物HPLC圖譜峰的保留時間和相對峰面積

圖4 靈芝子實體提取物的HPLC圖譜

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FENG Huiqin1，YANG Mingjun1，YANG Xiaotong1，YANG Qingyao2*

(1.College of Life and Environment Sciences Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2.Shanghai Zhi-herb Bio-tech.LTD，Shanghai 200234，China）

Determ ination of total triterpenoid acids in different part and extract of Ganoderma lucidum

Aim To develop amethod for determination of total triterpenoid acids in differentpartand extracts ofGanoderma lucidum.Method The samples ofGanoderma lucidum were extracted with ethanoland successively extracted with CHCl3and 5%NaHCO3，the NaHCO3layerwas acidified to pH 3 with 2mol／LHCl，the resulting precipitateswere dissolved in CHCl3and evaporated in vacuo then weighed.The total triterpenoid acidswere obtained.Result The total triterpenoid acids of Ganoderma lucidum fruitbody，spore and mycelium were(8.58±0.25）mg／g，(3.48±0.03）mg／g and(1.75±0.09）mg／g respectively.The total triterpenoid acids of pileus and stipe were(12.62±0.22）mg／g and(7.66±0.08）mg／g.The range of total triterpenoid acid content among 10 batches ofGanoderma lucidumfruitbody purchased from the market was between 4.34 to 16.39 mg／g.The highest content fro／8／8／88／m Ganoderma lucidum fruiting body with alcohol-water extracting was(208.70±5.54）mg／g and the lowest contentwith alkaline solution extracting was(123.07±4.99）mg／g.The composition of total triterpenoid acid from fruitbody，spores and extract of fruitbody analyzed by HPLCwere almost the same.Thismethod is reliable for determination of total triterpenoid acid in the fruiting body and its extracts，spore and mycelium from Ganoderma lucidum，which provides an indicator for the quality of Ganoderma lucidum product.

Ganoderma lucidum；total triterpenoid acids；fruitbody；spore；mycelia；extract of Ganoderma lucidum

Q949.329＋.7

A

1000-5137(2013）02-0192-05

（責任編輯：顧浩然）

2012-11-02

上海師范大學橫向基金項目(C-6105-09-DL0703）

馮慧琴(1965-），女，上海師范大學微生物與免疫學研究所副研究員；楊慶堯(1936-），男，上海師范大學生命與環境科學學院教授.

*通信作者