肌酐酶法與堿性苦味酸法測定尿中肌酐含量的對比分析

王凱 彭珊茁 鄭曉梅 魏明至

肌酐被用于尿液中毒物含量檢測的校正。在一般情況下飲食、飲水量和利尿劑對肌酐的排出率沒有太大影響，每日的變化很小。用肌酐量來表示被測物濃度水平與接觸濃度有較好的相關性。目前，尿肌酐測定的行業標準為堿性苦味酸分光光度測定法［1］(WS/T 97-1996)。該方法為手工法，與全自動化的肌酐酶法相比較，操作繁瑣且效率較低。作者通過試驗對比，肌酐酶法可以替代堿性苦味酸法用于尿肌酐含量的測定。

1 資料與方法

1.1 堿性苦味酸法

1.1.1 儀器 UV2100紫外-可見光分光光度計(北京萊伯泰科)。

1.1.2 試劑 約15 g/L飽和苦味酸溶液(臨用前過濾);100 g/L氫氧化鈉溶液;堿性飽和苦味酸溶液(氫氧化鈉溶液+飽和苦味酸上清液=1+10，臨用前配制);0.1 mol/L鹽酸(GR級);肌酐貯備液(經110℃干燥2 h的肌酐100 mg，以鹽酸溶液稀釋至100 ml，配成濃度1.0 mg/ml肌酐貯備液);肌酐標準液(肌酐貯備液用水稀釋成0.1 mg/ml的標準溶液);肌酐標準曲線(分別取標準液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml，加水至3 ml，再向各管加入2 ml堿性苦味酸溶液，混勻，于室溫下反應 20 ～30 min，加水 5 ml，混勻，配制成濃度為 0、1、2、3、4、5 μg/ml標準應用液);試驗用水全部為超純水。

1.1.3 原理 肌酐與過量苦味酸在堿性條件下反應生成橙紅色苦味酸肌酐。在波長490nm處比色定量。

1.1.4 方法 取25 μl尿樣置于10 ml比色管中，加水至3 ml，空白直接加3 ml水。向各管加入2 ml堿性苦味酸溶液，混勻，于室溫下反應20～30 min，加水5 ml，混勻。在波長490 nm下測吸光度，在0.5 h內比色完畢。

1.2 肌酐酶法

1.2.1 儀器 TBA-120FR全自動生化分析儀(日本東芝)。

1.2.2 試劑 肌酐試劑盒(北京九強生物技術有限公司，批號08-0222);0.85%生理鹽水(0.85 g氯化鈉溶于100 ml水中);試驗用水為蒸餾水。

1.2.3 原理 第一反應，消除樣品中的內源性肌酸及肌氨酸。第二反應，樣品中的肌酐在肌酐酶的作用下生成肌酸。然后，在肌酸酶和肌氨酸氧化酶的作用下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下生成醌類色素，以測定肌酐濃度。

1.2.4 方法 取20 μl尿樣，以0.85%生理鹽水稀釋至1 ml，混勻后，上機測定。

1.3 樣品 留取隨機新鮮尿樣，立即用兩方法同時測定，每批測定均在1 h內完成。

2 結果

以兩種方法分別同時測定52例樣品，測定結果見表1。

表1 尿肌酐測定結果

兩種方法測定結果的正態性檢驗見表2，均為正態分布。

表2 正態性檢驗結果

兩種方法的相關系數r=0.839，P＜0.0005，相關系數有高度顯著性，兩方法一致度良好。對兩種方法結果進行配對t檢驗，t=-1.255，P=0.215，兩組數據無顯著性差異，二者不存在方法學誤差。

3 討論

3.1 線性范圍 肌酐酶法給定線性范圍為0-15 μg/ml，在本實驗室條件下，可以做到15 μg/ml。苦味酸法標準中給定線性范圍為 0 ～1000 μg/ml，給定的標準系列濃度為 0、200、400、600、800、1000 μg/ml。但按照其給出的標準系列配制步驟，從標準貯備液算起，實際配制的標準系列濃度應為0、2、4、6、8、10 μg/ml，相差了 100 倍，不知為何原因。在本實驗室條件下，苦味酸法的線性范圍為0～6 μg/ml。所以，在本試驗中，肌酐酶法的線性范圍明顯高于苦味酸法。

3.2 尿樣稀釋倍數 肌酐酶法要求尿樣稀釋50倍，在本試驗中，在此稀釋倍數下，絕大多數樣品測定值均落入標準曲線線性范圍內(0～15 μg/ml)，其余少數樣品至多稀釋100倍?？辔端岱藴手心驑酉♂?00倍，但在本試驗中，在此稀釋倍數下，絕大多數樣品測定值均在線性范圍之外(0～6 μg/ml)。約60%的尿樣稀釋400倍，結果可落在線性范圍內。所以，在本試驗中，苦味酸法的樣品稀釋倍數明顯高于肌酐酶法。稀釋倍數越大，測定結果的誤差也越大。

3.3 苦味酸法中超線性測定值再次稀釋的問題 超出線性范圍的樣品需再次稀釋測定。標準方法中未注明超線性的結果用什么稀釋，因其均以水定容，故本試驗均以水做稀釋劑。在試驗中發現，再次稀釋樣品的測定值要低于直接稀釋至線性范圍內的測定值。具體試驗如下:選取10份尿樣，分別同時進行兩種處理:A組直接稀釋400倍，按標準方法處理后測定，結果均處于線性范圍內;B組稀釋200倍，按標準方法處理后測定，結果均超出線性范圍，再以水將樣品稀釋2倍后測定，結果處于線性范圍內。對兩組數據進行配對t檢驗(表3)，有顯著性差異，再次稀釋組(B)測定值低于直接測定組(A)。

表3 尿肌酐測定值

基于上述結果作者認為，苦味酸法中再次稀釋對尿肌酐測定有影響。為嚴格控制實驗條件，本試驗的52份數據均為一次測定就落入線性范圍內的數據，經再次稀釋而得出的測定結果均沒有采用。

苦味酸法易受葡萄糖、維C、膽紅素等非肌酐色素原的干擾。肌酐酶法特異性好，是解決肌酐測定種非特異性干擾的根本途徑［2］。肌酐酶法操作簡單，快速，受限制條件較少，在大批量樣品檢測中效率明顯高于苦味酸法，是可以替代苦味酸法的尿肌酐測定方法。

［1］WS/T 97-1996.尿中肌酐分光光度測定方法.

［2］中華人民共和國衛生部醫政司.第3版.全國臨床檢驗操作規程，2006:465-468.