桑葉中1-脫氧野尻霉素生物活性及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

嚴(yán)金柱

桑葉中1-脫氧野尻霉素生物活性及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

嚴(yán)金柱

1-脫氧野尻霉素是桑葉中含量千分之一的生物堿類成分，本文綜述了目前研究報(bào)道的其降血糖、抗病毒、抗腫瘤等生理活性，以及測(cè)定其含量的四種分析方法：柱前衍生化高效液相色譜法、柱前衍生化反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測(cè)法及高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）等。

1-脫氧野尻霉素；生理活性；檢測(cè)方法

1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin,1-DNJ），分子式：C6H13NO4，分子量為163，化學(xué)名：3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，是一種多羥基哌啶類小分子生物堿。1-DNJ目前發(fā)現(xiàn)主要存在于桑樹植物和微生物中，桑樹植物是唯一發(fā)現(xiàn)含有1-DNJ類結(jié)構(gòu)化合物的植物。近年來，人們對(duì)生物堿類化合物研究，已經(jīng)證明了1-DNJ及其衍生物具有良好的抗糖尿病、抗病毒性感染等生物活性[1-2]。因此，運(yùn)用中藥現(xiàn)代化的技術(shù)手段，研究桑葉中微量DNJ的生物活性及檢測(cè)方法的考察，將會(huì)是桑葉等降糖類中藥現(xiàn)代化應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)。

1 1-DNJ的化學(xué)結(jié)構(gòu)及來源

目前已從桑葉中分離出6種多羥基哌啶類小分子生物堿化合物，分別是1-DNJ、DAB、Fagomine、N-Me-DNJ、GAL-DNJ及CalysteginB2，母核1-DNJ分子結(jié)構(gòu)如圖1[3]。

圖1 1-DNJ的分子結(jié)構(gòu)

近期發(fā)現(xiàn)多種微生物和動(dòng)物中均含有DNJ及其類似物，如芽孢桿菌（Bacillus）和淺白灰鏈霉菌GC-148（Streptomyces Lavendulae GC-148）等。另外，由于蠶的飲食來源為桑葉，梁明等[4]在其體內(nèi)檢測(cè)到含量累積的DNJ等成分，因此從上述以含有DNJ的植物為食的動(dòng)物體內(nèi)也可獲得。

1976年DNJ由Maruo命名為Moranoline，從桑根皮中分離得到。隨后的研究中證明了桑類植物是DNJ含量最高的植物，因此桑葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)可以不再僅以黃酮為指標(biāo)，DNJ的含量也可作為重要指標(biāo)。桑葉中藥資源學(xué)研究方面，劉凡等[5]以廣東桑、魯桑、白桑和雞桑4個(gè)桑種的98份桑樹品種資源為材料，對(duì)各品種資源的桑葉總生物堿含量和DNJ含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：不同品種資源間差異明顯，白桑中的總生物堿和DNJ含量最高。而對(duì)于季節(jié)性等生長因素對(duì)桑葉藥材中DNJ含量影響的桑葉資源學(xué)考察中，歐陽臻等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明桑葉中DNJ含量與生長季節(jié)、溫度有關(guān)，七、八月份DNJ含量最高。

2 DNJ的生物活性

2.1 DNJ對(duì)α-糖苷酶抑制作用古籍中有記載，桑葉可用來止消渴，如《本草綱目》中有記載，桑葉可“汁煎代茗，能止消渴”；“灸熟煎飲，待茶止渴”。現(xiàn)代藥學(xué)研究證明，桑葉六種多羥基生物堿中DNJ含量較豐富，占生物堿含量＞50%；藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)DNJ是一種較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可有效抑制小鼠和人類餐后血糖的升高[8]。

DNJ具有較強(qiáng)的對(duì)各種α-糖苷酶的抑制活性[9]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑葉提取物具有降血糖作用，而已被證明的桑葉降血糖機(jī)制之一就是桑葉中含有的DNJ是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑[10-12]。Miyahara等對(duì)桑葉乙醇提取物降低正常大鼠餐后血糖濃度與劑量進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)其量效關(guān)系呈正相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)測(cè)定桑葉乙醇提取物抑制蔗糖酶、麥芽糖酶和淀粉酶的半數(shù)有效劑量（ED50）為0.11、0.44和0.38g?kg-1；半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為3.2、10和51mg?mL-1；桑葉DNJ抑制蔗糖酶、麥芽糖酶的IC50分別為0.015、0.21mg?mL-1，抑制效果與伏格列波糖（Voglibose）相當(dāng)，但其抑制α-淀粉酶（α-amylase）作用則稍弱[13]。

分子水平研究表明，DNJ可以通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制與葡萄糖苷酶上的位點(diǎn)結(jié)合，達(dá)到降低血糖水平的目的[7]。DNJ是一類具有類似于葡糖糖結(jié)構(gòu)的化合物，在體內(nèi)DNJ可與葡萄糖苷酶結(jié)合，且與葡萄糖苷酶的親和力相比，明顯優(yōu)于麥芽糖、蔗糖等二糖與葡萄糖苷酶的親和力，因此DNJ的競(jìng)爭(zhēng)性抑制了二糖與葡萄糖苷酶的結(jié)合，使二糖降解成單糖的概率降低，體內(nèi)的吸收減少，從而控制糖的利用，達(dá)到降血糖的作用[4]。

2.2 DNJ對(duì)α-葡萄糖淀粉酶的抑制作用DNJ具有對(duì)人體小腸內(nèi)α-葡萄糖淀粉酶的強(qiáng)抑制作用，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效控制餐后血糖的升高。DNJ抑制葡萄糖淀粉酶作用的IC50為14μg/ml。酶動(dòng)力學(xué)研究認(rèn)為DNJ對(duì)α-葡萄糖淀粉酶表現(xiàn)為混合性競(jìng)爭(zhēng)性抑制。目前臨床使用的阿卡波糖為非競(jìng)爭(zhēng)性糖苷酶抑制劑，其對(duì)糖苷酶的抑制作用與DNJ不同，推測(cè)DNJ對(duì)酶的修飾具有差異。

2.3 DNJ的抗病毒、抗腫瘤活性1-DNJ能夠抑制HIV-1復(fù)制，中斷感染循環(huán)，在治療艾滋病、乙型肝炎等病毒感染性疾病方面具有一定開發(fā)潛力。

當(dāng)HIV感染細(xì)胞時(shí)，包膜糖蛋白gp120先與CD4分子結(jié)合，然后再與CD4＋T細(xì)胞的輔助受體CXCR4結(jié)合，引起包膜蛋白的構(gòu)象改變，促進(jìn)包膜蛋白gp41和細(xì)胞融合，使HIV進(jìn)入細(xì)胞[14]。DNJ可使HIV包膜糖蛋白上的gp120N端的寡聚糖加工出現(xiàn)錯(cuò)誤，使其喪失與T淋巴細(xì)胞或免疫系統(tǒng)其它細(xì)胞表面的CD4受體的結(jié)合能力，減少或阻止合胞體形成，減弱HIV的感染力[15-16]。

HBV即乙型肝炎病毒主要通過PreS1與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合，其S蛋白與肝細(xì)胞膜上脂蛋白特異性相連，使HBV吸附并進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。DNJ衍生物對(duì)HBV具有抑制作用，彭忠田等[17]觀察DNJ的衍生物N-芐基-1-脫氧野尻霉素（P-DNJ）與N-壬基-1-脫氧野尻霉素（NN-DNJ）在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中有抗HBV的作用。

此外，DNJ據(jù)報(bào)道具有抗腫瘤活性。日本學(xué)者[18]利用β-16肺黑色細(xì)胞腫瘤模型，研究了DNJ及其衍生化合物的抗腫瘤作用。結(jié)果表明DNJ對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制率為80.5%，并推斷其可能是通過抑制葡萄糖苷酶的活性在腫瘤細(xì)胞表面產(chǎn)生未成熟的糖鏈，從而削弱腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。

3 DNJ的提取檢測(cè)方法研究

桑葉中DNJ含量極低，結(jié)構(gòu)亦決定其無紫外吸收，一般的紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜等無法檢測(cè)，因此選擇合適的檢測(cè)方法尤為重要。目前測(cè)定DNJ的分析方法主要有柱前衍生化高效液相色譜熒光檢測(cè)法、柱前衍生化反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)檢測(cè)法及高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）。

3.1 柱前衍生化高效液相歐陽臻等[6]建立了柱前衍生化高效液相色譜熒光檢測(cè)法來檢測(cè)DNJ含量的方法，桑葉經(jīng) 0.05mol/L鹽酸水溶液提取后，使用芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）與DNJ反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物，且此反應(yīng)在PH為8.5的硼酸鹽緩沖液條件下進(jìn)行。衍生完成后注入HPLC，以流動(dòng)相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（55：45，V/V）；流速：1.0ml/min；柱溫25℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長254nm，發(fā)射波長322nm條件下進(jìn)行測(cè)定。

3.2 柱前衍生化反相高效液相色譜-熒光檢測(cè)法Kim等[19]采用5mmol/L衍生劑芴甲氧酰氯FMOC-Cl在PH為8.5的0.4mol/L硼酸鉀緩沖液中對(duì)桑葉酸水提液進(jìn)行衍生前處理后，采用HPLC進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定條件為：C18柱，流動(dòng)相：乙睛-0.1%醋酸（1：1）；流速：1.0ml/min；使用FL3000型熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長為250nm，發(fā)射波長為322nm。此外測(cè)定DNJ采用的柱前衍生化法還有柱前硅烷衍生化氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜NuengC等采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法（HPLC-MS）測(cè)定了DNJ的含量[20]。建立的具體分析方法為：色譜柱（5μm,250×4.6mm i.d.），柱溫40℃。流動(dòng)相組成：0.1%的蟻酸（溶液A）和乙睛（溶液B）混合液，流速為600μL/min，進(jìn)樣量為5μL。分界面情況最佳的條件是：離子噴霧電壓為5500V，氣簾氣體為12psi，離子源氣體l為65psi，離子源氣體2為55psi，界面溫度為450℃，進(jìn)出口電壓分別為10V和45V，以5psiCAD、22VCE、5VCXP進(jìn)行電離。

3.4 高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD) Kimura等用乙睛水溶液（50：50/V：V，含6.0mmol/L的醋酸，PH8.5）浸泡桑葉粉末樣品[21]提取DNJ后，使用島津LC-10A HPLC系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱TsKgelAmide-80（4.6×250mm）；流動(dòng)相乙睛：水（81：19/v：v），溶液中含6.5mmol/L醋酸銨且PH值為5.5；流速1.0ml/min；柱溫為40℃；ELSD漂移管的溫度為55℃；霧化氣氣壓為1.2×105Pa；gain值為8。

3.5 直接HPLC法根據(jù)DNJ化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法可以直接測(cè)定其含量。歐陽華學(xué)等[22]采用配有G1362A示差折光檢測(cè)器的安捷倫液相色譜、以C18柱，乙腈-水（70：30），體積流量為1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)器溫度35℃的分析方法測(cè)定了1-DNJ的含量。柱前衍生化法、液質(zhì)聯(lián)用等方法雖可用于測(cè)定DNJ，但操作復(fù)雜、繁瑣，采用直接HPLC法對(duì)其測(cè)定簡(jiǎn)單快速。

4 展望

目前，桑葉中的DNJ生物活性研究主要集中于降血糖、抗病毒及抗腫瘤活性等領(lǐng)域，且研究機(jī)制基本明確。由于DNJ特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)限制及在生物界中含量極低等原因，目前研究中檢測(cè)手段的操作復(fù)雜繁瑣。因此，運(yùn)用中醫(yī)藥現(xiàn)代化新技術(shù)、新工藝從桑類資源中提取檢測(cè)純度較高的DNJ，應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，治療糖尿病、抗病毒、預(yù)防腫瘤發(fā)生發(fā)展等醫(yī)藥制劑及健康保健領(lǐng)域?qū)⑹且粋€(gè)發(fā)展趨勢(shì)。

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The Research Progress of 1 - deoxynojirimycin Biological Activity and Detection Methods in Mulberry Leaves

Yan Jinzhu

1-Deoxynojirimycin is the thousandth of the content of alkaloids in mulberry leaves, and this article focuses on 1-deoxynojirimycin, s hypoglycemic, anti-virus, anti-tumor and other physiological activities as well as four methods to detect the content DNJ, including precolumn derivatization HPLC, precolumn derivatization reversedphase HPLC - fluorescence detection, liquid chromatography - mass spectrometry detector, HPLC with evaporative light scattering detection (HPLC-ELSD).

1-deoxynojirimycin;Physiological activity;Detection method

R285.5;R284

A

1673-5846(2013)03-0057-04

廣東省英德市人民醫(yī)院，廣東清遠(yuǎn) 513000

嚴(yán)金柱（1957-），男，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)管理和醫(yī)院制劑的開發(fā)，Email：15820294321@139.com。