益氣活血法抗乳腺癌EMT6細胞增殖的荷瘤小鼠體內篩方研究

王 輝杜欣穎，3花寶金孫桂芝

（1中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤科，北京，100053；2中國中醫科學院腫瘤研究所，北京，100053；3中國兵器工業北京北方醫院，北京，100089）

實驗研究

益氣活血法抗乳腺癌EMT6細胞增殖的荷瘤小鼠體內篩方研究

王 輝1，2杜欣穎1，2，3花寶金1，2孫桂芝1，2

（1中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤科，北京，100053；2中國中醫科學院腫瘤研究所，北京，100053；3中國兵器工業北京北方醫院，北京，100089）

目的：篩選抗乳腺癌增殖的益氣藥、活血藥適宜配伍。探討益氣藥、活血藥抗腫瘤的配伍的內在含義。方法：建立小鼠乳腺癌EMT6細胞BALB／C小鼠荷瘤模型。按照處理方式設立：空白對照組（Control）；紫杉醇組（Taxel）；黃芪+蘇木組（HQ+ SM）；黃芪+蘇木+蒲黃組（HQ+SM+PH）；黃芪+蘇木+蜂房組（HQ+SM+FF）；黃芪+蘇木+炮山甲組（HQ+SM+PSJ）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房組（HQ+SM+PH+FF）；黃芪+蘇木+蒲黃+炮山甲組（HQ+SM+PH+PSJ）；黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組（HQ+SM+FF+PSJ）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房+炮山甲組（HQ+SM+PH+FF+PSJ），共10組。成瘤小鼠共100只，隨機分入以上各組中，每組10只。分別給予生理鹽水、中藥組方灌胃，生理鹽水、紫杉醇注射液腹腔注射。觀察成瘤后第8天，荷瘤重量。并計算抑瘤率。結果：黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組腫瘤組織塊重量明顯小于空白對照組，差異具有統計學意義，P＝0.049＜0.05，該組抑瘤率為27.05%。結論：益氣藥、活血藥組合黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲，具有抑制乳腺腫瘤EMT6細胞在BABL／C小鼠體內增值的作用。具有進一步研究價值。

益氣；活血；乳腺癌；增殖

乳腺癌是嚴重威脅婦女生命健康的惡性疾病。在世界范圍內，其發病率和死亡率居第三位［1］。近年來，多數學者認為益氣活血法是乳腺癌中醫藥診療的重要治法。獲得具有抗腫瘤作用的益氣藥、活血藥的適宜配伍，是進一步研究益氣藥、活血藥抗乳腺癌增殖、侵襲、轉移的基礎。根據既往實驗研究結果，綜合文獻報道及臨床運用實際，我們在本實驗選取黃芪、蘇木、生蒲黃、蜂房、炮山甲為候選藥物，觀察其不同組合抗小鼠乳腺癌EMT6細胞在BAB／C小鼠體內增殖能力的共性及差異，篩選適宜的益氣藥、活血藥組合。

1 材料

1.1 動物 BALB／C小鼠，雌性，6～8周齡，體重（20 ±2）g，SPF級，由北京嘉軒科技有限公司提供，北京大學醫學部實驗動物科學部SPF級屏障環境喂養。

1.2 藥物 黃芪浸膏，每克含生藥2.8g，生產批號：20080308。蘇木浸膏，每克含生藥0.4g，生產批號：20100122。生蒲黃浸膏，每克含生藥0.4g，生產批號：20091206。蜂房浸膏，每克含生藥0.24g，生產批號：20100106。以上藥物均由中國中醫科學院廣安門醫院制劑中心提供。炮山甲煎液，自制，每毫升約含生藥6g。紫素注射液，北京協和制藥廠，批號：101011。

1.3 細胞株 EMT6乳腺癌細胞，由北京大學醫學部免疫學系王露教授惠贈。

1.4 主要儀器 MLS-3750全自動消毒鍋，日本SANYO。SARTRIOUS電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。TE200-U倒置顯微鏡，日本NIKON。古威牌超凈工作臺，北京昌平長城空氣凈化工程公司。血細胞計數板，上海精密儀器儀表有限公司。

1.5 主要試劑 1640培養液，購自Hyclone公司。胎牛血清，購自Hyclone公司。青霉素、鏈霉素雙抗，中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心提供。

2 方法

2.1 EMT6細胞復蘇及培養 液氮中取出EMT6細胞，迅速置入38℃溫水中，待凍存液融化，將凍存液轉移至盛有10mL培養液的15mL離心管內，1000r／min離心5min，棄上清，2m L培養液重懸細胞，轉移至25cm2培養瓶中，加入培養液至5mL，37℃5%CO2培養箱培養，適時傳代。

2.2 EMT6細胞BALB／C小鼠荷瘤模型的建立 取傳代后24hEMT6細胞，倒置顯微鏡觀察細胞狀態良好，細胞密度為70%左右，0.25%胰酶消化，培養基中和，10000r／min離心5min，3mL培養基重懸，臺盼藍染色并計數，調整活細胞密度為2×107個／mL，每只小鼠左側腋下接種0.1m L腫瘤細胞懸液。接種后第4天觀察，BALB／C小鼠左側腋下瘤塊直徑＞0.4cm為成瘤，模型建立成功。

2.3 分組及給藥 小鼠成瘤后，隨機分組，每組10只，處理方法如下：接種后第5天開始給予各組處理。空白對照組予生理鹽水灌胃+生理鹽水腹腔注射；紫杉醇化療組予生理鹽水灌胃+紫杉醇腹腔注射；各治療組予與其分組名相同中藥組合湯劑灌胃+生理鹽水腹腔注射。其中：生理鹽水灌胃0.2mL／次，每日1次。生理鹽水腹腔注射液0.2mL／次，每日1次。紫杉醇注射液以生理鹽水稀釋，小鼠腹腔注射劑量30mg／kg，0.2mL／次，每日1次。不同試驗組中藥復方灌胃，以生理鹽水配制灌胃湯劑，黃芪劑量5g／kg，蘇木劑量1.67g／kg，生蒲黃1.67g／kg，蜂房1.67g／kg，炮山甲1.67g／kg。

2.4 觀察指標 瘤重和抑瘤率：于接種后第12天，即開始給藥干預后第8天，將每組小鼠處死，剝離腫瘤組織，稱取瘤重，計算抑瘤率。計算公式如下：

抑瘤率（%）＝［1-實驗組平均瘤重（g）／對照組平均瘤重（g）］×100%

2.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，各組數據資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。

表1 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠瘤重表

3 結果

經Shapro-Wilk檢驗，各組瘤重數值均符合正態分布。空白對照組（P＝0.503＞0.05）；紫杉醇組（P＝0.055＞0.05）；黃芪+蘇木組（P＝0.774＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃組（P＝0.145＞0.05）；黃芪+蘇木+蜂房組（P＝0.60837＞0.05）；黃芪+蘇木+炮山甲組（P＝0.398＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房（P＝0.478＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+炮山甲組（P＝0.329＞0.05）；黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組（P＝0.568＞0.05）；黃芪+蘇木+蒲黃+蜂房+炮山甲組（P＝0.684＞0.05）。

Levene值＝1.206，P＝0.301，具有方差齊性。LSD法兩兩比較，空白對照組與其他處理組相比，其中黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組與空白對照組差異有統計學意義，P＝0.049＜0.05。

表2 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重及抑瘤率表

圖1 益氣活血藥不同拆方組合BALB／C荷瘤小鼠平均瘤重圖

4 討論

根據實驗結果，可以初步確認，益氣活血藥物（黃芪+蘇木+蜂房+炮山甲組合），在BALB／C小鼠活體內具有抑制乳腺癌EMT6細胞生長的作用，表現出良好的深入研究苗頭。

據中醫理論分析，該組合具有益氣培本、活血通絡、軟堅攻毒的作用。結合中醫學對腫瘤正虛邪實、瘀毒夾雜的病理特點，本實驗最終篩藥組合與中醫理論相符合。近年來，益氣活血法指導的中藥方劑抗腫瘤研究逐漸得到諸多學者重視與研究，并在臨床運用和基礎研究中作了部分探索。王笑民等［2］從癥候學角度研究發現，108名非小細胞肺癌患者中有60.20%的患者存在不同程度的氣虛血瘀證，并提出T細胞亞群、血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、纖維蛋白原及纖維蛋白溶解酶等指標是改變氣虛血瘀證的病理生理基礎。徐詠梅等［3］報道，采用益氣活血法為指導組方的固本抑瘤Ⅱ號能增強化療療效，減輕化療毒副作用，并以血栓素、纖維蛋白原、6-酮-前列腺素F1α、纖溶酶等為指標，觀察到益氣活血法可減輕腫瘤患者化療后的血液高凝狀態。基礎實驗研究方面，郝鈺、李東濤、李萍萍等［4-6］均報道，不同益氣活血組方對腫瘤均有一定的抑制作用。

本研究藥物組合中，黃芪為豆科黃芪屬植物的根。甘、溫，歸肺、脾經。具有益氣升陽，固表止汗，利水消腫，托毒生肌等功效。《本經》：主癰疽，久敗瘡，排膿止痛。《別錄》：逐五臟間之惡血。《本草備要》：排膿內托，瘡癰圣藥。任美萍［7］等報道，黃芪多糖在體外以CCK-8法進行檢測，發現其對K562、SMMC-7721、HCT116和A549細胞系無增殖抑制作用，而在體內可以提高荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平，并抑制荷瘤小鼠體內H22、S180腫瘤細胞的活性。張喜林［8］等報道，黃芪總提物能夠降低HepA肝癌荷瘤小鼠血清ALT、AST及ALP水平，提高淋巴細胞含量，并能抑制抑制瘤的生長。陳坤［9］等報道，一定體積分數的黃芪注射液（3.45%和1.70%）具有促進人食管癌細胞株TE-13生長的作用，并且該促進作用有一定的計量依賴。

蘇木為豆科蕓實屬植物蘇木的心材。甘、咸、微辛、平。歸心、肝、大腸經。具有活血祛瘀，消腫定痛等功效。《本草綱目》：三陰經血分之藥。《醫學啟源》：破死血。《醫林攥要》：補心散瘀，除血分妄作之風熱。徐建華［10］等報道，蘇木提取液在體外能夠顯著促進K562細胞的凋亡，且呈一定的劑量依賴關系。并可延長肝癌H22腹水小鼠的生存時間。

蜂房為胡蜂科胡蜂屬昆蟲黃星長腳黃蜂的巢。微甘、平、小毒，歸肝、胃、腎經。具有攻毒消腫的功效。《本草匯言》：祛風攻毒，散疔腫惡毒。《外科全身集》：能托毒，療久潰，止痛。報道，蜂房提取物在體外對多種腫瘤細胞存在抗增殖活性，其可以通過降低Bcl-2蛋白細胞內表達，誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯。但是蜂房提取物在高濃度下對造血干細胞具有毒性作用，低濃度確促進正常造血干細胞的增殖。［11］

炮山甲為鯪鯉科鯪鯉屬動物鯪鯉的鱗片。經過鍋內砂子武火炒熱，拌炒至鼓起并呈金黃色而成。咸，微寒。歸肝、胃經。《本草綱目》：通經絡。下乳汁，消癰腫，排膿血。《本草再新》：解熱敗毒。炮山甲抗腫瘤作用的現代研究較少，多為臨床經驗報道。

在本研究中，紫杉醇組設置為陽性對照，具有較好的抑瘤率，但是進行統計發現，與空白對照組相比較，差異無統計學意義。考慮為樣本量尚偏小所導致。單純從抑瘤率角度進行分析，可以看到，具有炮山甲的藥組與除炮山甲外其余藥物均相同的藥物組，其抑瘤作用均為明顯。炮山甲是否能夠作為抗腫瘤生長中藥復方中的增效單味藥，值得繼續深入研究。結合現有文獻報道，對于益氣活血藥單味中藥抗腫瘤作用的研究，如黃芪、蘇木等，具有學者發現劑量依賴等關系。因此，對于益氣活血藥物復方組合是否具有劑量依賴的抗腫瘤作用，仍然需要做大量的工作。

［1］周際昌.實用腫瘤內科學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：511.

［2］王笑民，郁仁存，王禹堂.晚期非小細胞肺癌患者氣虛血瘀證的研究［J］.中國中西醫結合雜志，1994，14（12）：724-726.

［3］徐詠梅，郁仁存.益氣活血法治療腫瘤經驗.［J］.中醫雜志，2010，51（6）：110-111.

［4］李東濤，吳志奎，孫桂芝等.益氣、活血軟堅、解毒法對荷瘤小鼠腫瘤生長抑制的實驗研究［J］.江蘇中醫藥，2010，42（4）：74-75.

［5］郝鈺，徐泊文，王伊光等.益氣活血解毒方體內外抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中華中醫藥雜志，2005，20（10）：632-634.

［6］李萍萍，呂桂芝，孫紅等.益氣活血中藥復方對腫瘤細胞增殖的抑制作用［J］.中國中藥雜志，1996，21（2）：113-115.

［7］任美萍，劉明華，李蓉，等.黃芪多糖抗腫瘤活性研究［J］.中國新藥雜志，2010，19（3）：221-224.

［8］張喜林，孛文虎，李路勇，等.黃芪總提取物抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中國現代藥物運用，2010，4（4）：29-31.

［9］陳坤，高獻書，盧付河，等.黃芪、參芪促腫瘤生長作用的觀察［J］.河北醫科大學學報，2004，25（1）：33-34.

［10］徐建華，郭素堂，喬麗娟，等.蘇木提取液抑制腫瘤作用的研究［J］.腫瘤研究與臨床，2006，11（8）：726-727.

［11］張坤，魏金榮，關一夫.蜂房提取物中抗腫瘤成分的活性研究［J］.中醫雜志，2010，51（S2）：246-248.

（2013-10-30收稿）

A sp lit-side Research of Qi Boosting and Blood Quicken Formula’s Function in Inhibiting the Proliferation of Breast Cancer Cell EMT6 in a Tumor Burdened M ice M odel in Vivo

Wang Hui1，2，Du Xinyin1，2，3，Hua Baojin1，2，Sun Guizhi1，2
（1 Oncology Department of Guang’anmen Hospital affiliated to China Academy of ChineseMedicine Science，Beijing 100053，China；2 Cancer Institute of China Academy of Chinese Medicine Science，Beijing 100053，China；3 Northern Hospital of China North IndustriesGroup Corporation，Beijing 100089，China）

Objective：To get effective compatibility of Chinesemedicine herbs which would boost qi and quicken blood for inhibiting proliferation of breast cancer cells.And also to explore the connotation of herbs compatibility to treat cancer.M ethods：Breast cancer cell EMT6 burdened BALB／Cmicemodelwere established.Ten groupsweremade including control group（Control），Taxel group（Taxel），Huangqi+Sumu group（HQ+SM）；Huangqi+Sumu+Puhuang group（HQ+SM+PH）；Huangqi+Sumu+Fengfang（HQ+SM+FF）；Huangqi+Sumu+Paoshanjia（HQ+SM+PSJ）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Fengfang（HQ+SM+PH+ FF）；Huangqi+Sumu+Puhuang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM +FF+PSJ）；Huangqi+Sumu+Fengfang+Fengfang+Paoshanjia（HQ+SM+PH+FF+PSJ）.100 tumor burden m ice were randomly divided into these ten groupswith tenmice in each group.Chinesemedicine formula and saline were administered intragastrically to different groups aswell as saline and Taxelwere given by interoperatoneal injection.The burdened tumorweightwasmeasured 8 days after forming the tumors and the tumor inhibition rate was observed.Results：The weight of burden tumor of the Huangqi+Sumu+ Fengfang+Paoshanjia group（HQ+SM+FF+PSJ）wasmuch smaller than thatof the control group.The differencewasstatistically significant，P＝0.049＜0.05.The tumor inhibition rat of（HQ+SM+FF+PSJ）group was 27.05%.Conclusion：The Chinesemedicine herbs compatibility with Huangqi，Sumu，Fengfang and Paoshanjia has the function of inhibiting the proliferation of breast cancer cell EMT6 in BALB／Cm ice in vivo.

Yiqi；Huoxue；Breast cancer；Proliferation

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.022

國家自然科學基金（編號：81072970）

王輝，男，30歲，浙江人，醫學博士，研究方向：中西結合腫瘤臨床與基礎研究

孫桂芝，主任醫師，教授，博士生導師，博士后合作導師，全國第四批名老中醫，研究方向：中西結合腫瘤臨床與基礎研究，地址：北京市西城區北線閣5＃中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤科，郵編：100053，電話：010-88001192