三七總皂苷對腦出血大鼠凝血酶及神經功能的影響

趙雪松陳志剛高 芳徐枝芳

（1北京中醫藥大學第二附屬醫院東方醫院神經內科，北京，100078；2日本昭和大學醫學部顯微解剖教室，日本，142-8555）

三七總皂苷對腦出血大鼠凝血酶及神經功能的影響

趙雪松1陳志剛1高 芳1徐枝芳2

（1北京中醫藥大學第二附屬醫院東方醫院神經內科，北京，100078；2日本昭和大學醫學部顯微解剖教室，日本，142-8555）

目的：研究三七總皂苷對腦出血大鼠凝血酶及神經功能影響。方法：SD雄性大鼠200只隨機分為空白組、假手術組、模型組、用藥組，每組又有6 h，24 h，48 h，72 h，7天5個時間點?？瞻捉M每組5只，其余每組每個時間點10只大鼠。采用尾殼核注入膠原酶肝素生理鹽水溶液法建立大鼠腦出血模型，治療組給予三七總皂苷腹腔注射，每天一次。在相應時間點，采用改良的神經功能缺損評分（Modified neurological severity score，mNSS）對實驗動物造模后各時間點神經功能缺損進行評價。結果：各時間點模型組mNSS和空白組假手術組比，明顯升高，差異有統計學意（P＜0.05），除6 h外，各時間點模型組和用藥組比，用藥組mNSS明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。測定纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時間，纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時間48 h模型組和用藥組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：腦出血模型組中，6 h開始，mNSS明顯增高，到48 h達到高峰，以后逐漸下降，三七總皂苷可以明顯下調mNSS評分。纖維蛋白原含量和纖維蛋白原凝血時間在模型組升高，用藥組下降，說明三七發揮了發揮了活血行淤作用。

腦出血；三七總皂苷；凝血酶；mNSS

腦出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）是最危重的一種卒中類型，占所有卒中事件10%～25%［1］。ICH的病死率明顯高于缺血性卒中，直接病死率為38%～43%，病殘率為70%～80%［2］，其復發率約為1.8%～11%［3］。ICH具有發病急、變化快、病情危重、病機復雜等特點，臨床必須緊急救治，故急性期救治對提高搶救成功率和患者的生存質量具有重要意義。目前關于ICH急性期的治療無突破性的進展，尤其是內科治療，多限于脫水降顱壓、調整血壓、改善營養代謝和防治并發癥等對癥及支持療法，缺乏針對性強、有效的治療手段，多數ICH患者都留下神經功能缺損。ICH后腦損傷的機制很多，包括血腫的擴大、血腫周圍組織缺血（缺血性半暗帶）、血腫周圍組織腦水腫等［4］，在血腫形成過程中和形成后，都存在腦水腫，在腦水腫發生機制中，凝血酶的作用受到了廣泛關注。它是凝血級聯反應的基本成分，腦出血后迅速生成。腦水腫和凝血酶都具有神經毒性，破壞神經的正常功能，本研究通過三七總皂苷對腦出血大鼠凝血酶及神經功能評分的影響，探討其對腦出血的治療作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與動物模型的制備

1.1.1 實驗動物與分組 SD雄性大鼠，體重230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠隨機分為空白組，假手術組，模型組，用藥組四個組，每組又分為6 h，24 h，48 h，72 h，7天5個時間點。每組每個時間點10只大鼠。

1.1.2 主要實驗設備及試劑 立體定位儀（日本stoelting公司），Ⅳ型膠原酶（sigma公司，貨號C-5138），三七總皂苷（廣西梧州制藥集團股份有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A型），離心機（eppendorf Centrifuge 5810R）。微量進樣器（上海安亭器械廠）。

1.1.3 動物模型制作與給藥 腦出血模型制備參考Rosenberg等的方法。以10%水合氯醛（0.4 mg／100 g）腹腔麻醉。俯臥固定大鼠于動物頭顱立體定位儀，頭皮丁字切開，取前囟為原點，向右3 mm、向后1 mm、深度5.5 mm為注射點（尾殼核），骨鉆鉆開顱骨，進針后緩慢注射藥物溶液，留針5 min，緩慢退針。切口撒適量青霉素鉀粉，縫合皮膚后回籠飼養?？瞻讓φ战M不做任何處理，普通飼養，自動飲水。假手術組顱內注入2μL滅菌生理鹽水，普通飼養，腹腔注射生理鹽水（1 mL／100 g）。模型組注射膠原酶／肝素鈉／生理鹽水溶液2.0μL（每1μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U），普通飼養，腹腔注射生理鹽水（1 mL／100 g）。用藥組造模同模型組，腹腔注射三七總皂苷注射液（血栓通粉針150 mg／支）7.2 mg／100 g，于造模后立即給藥1次，之后每24 h給藥1次。三七總皂苷注射液配置，150 mg溶入15 mL生理鹽水中，溶液中含10 g／mL血栓通針粉，每100 g體重給藥0.72 m L。

1.2 實驗方法

1.2.1 mNSS評定神經功能 將每組各時間點大鼠在在相應時間點做mNSS評分，mNSS，改良神經功能評分，是目前國際上公認的大鼠腦卒中后神經功能缺失評判標準，主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動。最大得分為18分，缺少一項反射或動物不能完成一項任務給1分，輕型傷：1～6分，中型傷：7～12分，重型傷：13～18分，具體如下。提尾反射（正常0分，最大3分）前肢屈曲1分；后肢屈曲1分；頭上抬距垂直軸＞100，且維持在30 s之內1分。行走測試（正常0分，最大3分）正常行走0分；不能走直線1分；向偏癱側轉圈2分；向偏癱側傾倒3分。感覺測試（正常0分，最大2分）視覺和觸覺測試1分；深感覺測試（拉爪子加強肌肉收縮）1分。

平衡測試（正常0分，最大6分）平衡良好0分；抓住平衡木的邊緣1分；懸蕩并且一只爪子掉下來2分；懸蕩并且兩只爪子掉下來或者在平衡木上旋轉（＞60 s）3分；試圖在平衡木上保持平衡但失?。ǎ?0 s）4分；試圖在平衡木上保持平衡但失?。ǎ?0 s）5分；掉下來，沒有試圖在平衡木上保持平衡6分。

反射缺失和反常運動（正常0分，最大4分）耳廓反射（當耳廓被觸動時，頭晃動）1分；角膜反射（當用棉花輕觸角膜時，眼睛眨動）1分；驚嚇反射（噪音引起的運動反應）1分；抓握、肌陣攣、肌張力障礙1分。最大得分18分。

1.2.2 取血及凝血酶測定 將每組各時間點大鼠在在相應時間點麻醉，剪開腹腔，分離出腹主動脈，用一次性采血針和枸櫞酸鈉抗凝管采血，采出血后，上下緩慢混勻，然后迅速插入冰里，準備離心，離心條件是40C3000轉離心10 min，取上清分裝備用。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析，各組數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mNSS評分測定 空白組由于沒有干預，所以沒有神經功能障礙，假手術組注射生理鹽水對大鼠腦組織有損傷，動物干預后會存在短時的神經功能障礙，24 h時神經功能恢復正常；腦出血組神經功能評分較高，在48 h時神經功能缺失最重，同假手術組相比，有明顯差異（P＜0.05）；治療組運動、感覺、平衡以及反射四個方面缺失程度減輕，mNSS神經功能評分明顯低于腦出血組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 腦出血三七總皂苷治療后mNSS評分的變化（）

表1 腦出血三七總皂苷治療后mNSS評分的變化（）

6 h 24 h 48 h 72 h 7 d空白對照組組別0±0 0±0 0±0 0±0 0±0假手術組1.50±0.71 0.3±0.48 0±0 0±0 0±0模型組6.30±0.95 10.0±1.25 12.5±1.51 12.0±0.67 8.30±0.67用藥組5.90±0.74*8.10±0.74*10.9±0.86*9.5±0.71*5.70±0.82*P 0.247 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 三七總皂苷治療后血漿中FIB和FIBs的變化（）

表2 三七總皂苷治療后血漿中FIB和FIBs的變化（）

注：模型組和用藥組相比，*P＜0.05。

組別只數FIB（g／L）FIBs（s ）假手術組3.65±0.85 5.17±0.95模型組3 5.40±0.84*3.63±0.51*用藥組3 3.17±0.81*5.87±1.25*P 3 0.017 0.028

2.2 凝血酶測定 取48 h血漿測凝血酶相關指標，選取纖維蛋白原含量（FIB）和纖維蛋白原凝血時間（FIBs）兩個指標檢測。見表2。

3 討論

ICH后腦損傷的機制很多，包括血腫的擴大、血腫周圍組織缺血（缺血性半暗帶）、血腫周圍組織腦水腫、炎性反應、細胞凋亡、氧自由基和補體級聯反應等［4］，各種機制之間又存在千絲萬縷的關聯。ICH后最初的損傷是由血腫擴大導致機械性壓力所造成的；在血腫形成過程中和形成后，都存在水腫，造成了對腦組織的進一步損傷［4］。在腦水腫發生機制中，凝血酶的作用受到了廣泛關注。它是凝血級聯反應的基本成分，腦出血后迅速生成。早期水腫的形成牽涉到凝血級聯反應的激活和凝血酶的產生，后期則主要是凝血酶引起的血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）破壞所致的血源性水腫。凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶，由無活性的凝血酶原產生，催化纖維蛋白原轉變為纖維蛋白。凝血酶神經作用機制較為復雜，凝血酶［5］參與凝血，引起血小板聚集分泌、血栓素的形成和平滑肌收縮；凝血酶與內皮細胞快速結合，刺激內皮細胞釋放血小板活化因子、內皮素、前列腺素和內皮源性松弛因子。在腦出血后除參與凝血外，還是一種重要的神經毒性遞質，它能引起腦水腫，破壞血腦屏障和產生細胞毒性作用，引起神經元損傷。vaughan等人［6］研究發現小劑量凝血酶產生神經保護作用，大劑量則具有細胞毒性作用。當出血破入大腦后，主要由外源性凝血途徑產生大劑量凝血酶，持續直至凝血酶原耗盡，依次激活產生腦水腫的途徑［7］。凝血酶對神經細胞的毒性作用以及對血腦屏障的損傷可能是腦出血后腦水腫加重的重要機制。凝血酶本身和凝血過程中產生的一系列物質及腦水腫是引起腦損傷和神經功能缺損的重要因素。

ICH屬中醫“中風”范疇，傳統醫學觀點認為，中風皆由內因所致，是在氣血陰陽失調基礎上，風、火、痰、瘀等多種因素共同作用于人體，導致臟腑功能失調，氣血逆亂于腦部而發生的。其病位在腦，病性多為本虛標實、上盛下虛。腦出血后機體發生復雜的病理機制，“離經之血即為瘀”，出血性中風屬“離經之血，瘀于腦府”，以絡破血瘀貫穿發病全過程。發病之初，腦絡損而血溢，離經之血為瘀血，血行不暢，損傷腦絡、腦髓，進一步加重了出血和血瘀。一定程度上，“瘀血”病機與凝血、炎性反應、腦水腫、組織缺血等病理機制是相吻合的?，F代醫學影像呈現異常密度影，表明出血性中風為“惡血留內”，治療應以活血化瘀為第一要義，瘀血是痰、熱、毒的源頭，故需澄其源。

三七具有“止血不留瘀”的特點，三七的活性成分三七總皂苷，研究表明可改善血腫周圍微循環、降低血腦屏障通透性、清除自由基、減輕腦水腫以治療出血性中風。故選擇與凝血及腦水腫密切相關且之間又相互關聯的凝血因子為切入點，進行活血化瘀法治療腦出血模型作用機制的研究。三七作為活血化瘀法的代表藥物，具化瘀止血，活血定痛之功效，止血且不留瘀，適用于ICH血腫形成、繼發缺血及局部代謝障礙等形成的瘀血癥，其主要有效成分為三七總皂苷。三七總皂苷針劑成分較單一，已長期運用于臨床，作為本次活血化瘀的研究藥物，以探討ICH用藥后對腦出血大鼠凝血酶及神經缺損評分的影響。實驗研究表明，三七總皂苷可以改善腦出血周圍腦組織凝血酶的表達從而起到腦保護作用，可以改善神經缺損起到腦保護作用，為活血化瘀藥物用于治療腦出血提供可靠的實驗基礎，并進一步探討腦組織保護作用的機制。

本研究表明，大鼠腦出血模型制作后，6 h開始，mNSS評分明顯升高，到48 h達到高峰，以后逐漸下降。三七總皂苷腹腔給藥后，6 h組作用不明顯，可能與藥物作用時間段有關系，其余時間點，給藥后mNSS評分明顯下降，說明三七總皂苷對于減輕大鼠腦出血后神經功能缺損是有效的，為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實驗基礎。纖維蛋白原含量在用藥后下降，纖維蛋白原凝血時間在用藥后變長，說明血液中纖維蛋白原減少，三七發揮了活血行淤的作用，為臨床用活血化瘀法治療腦出血提供實驗依據。

［1］Lee JC，Cho GS，Choi BO，etal.Intracerebralhemorrhage-induced brain injury is aggravated in senescence accelerated pronemince［J］.Stroke，2006，37（1）：216-222.

［2］鄧寶康.臨床各科疑難病診治與康復［M］.西安：世界圖書出版西安公司，2000：9.

［3］Passero S，Burgalassi L，DAndrea P，et al.Recurrence of bleeding in patientswith Primarily intracerebral hemorrhage.Stroke，1995，26（7）：1189 -1192.

［4］Gong Y，Hua Y，Keep RF，etal.Intracerebral hemorrhage：effects of aging on brain edema and neurological deficits［J］.Stroke，2004，35（11）：2571-2575.

［5］鄭國慶.凝血酶在腦出血后的作用［J］.心腦血管病防治，2004，6（4）：56-58.

［6］Vaughan PJ，Pike CJ，Cotman CW，et al.Thrombin receptor acti.ration protects neurons and astroeytes from cell death Produced by environmental insults.JNeurosei，1995，15（7）：5389-5401.

［7］吳文輝，許麗珍.凝血酶致腦水腫的實驗觀察［J］.中國血液流變學雜志，2003，13（2）：133-134.

（2013-06-21收稿）

Im pact of Panax Notoginseng Saponins on the Cerebral Edema of Rats w ith Coagulation Cascade Pathway via Neurologic Im pairment

Zhao Xuesong1，Chen Zhigang1，Gao Fang1，Xu Zhifang2
（1 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China；2 Department of Anatomy，Showa University，School of Medicine，Tokyo，Japan，142-8555）

Objective：To investigate the effects of Panax notoginseng saponins（PNS）on the cerebral edema and thrombin in the rats with cerebral hemorrhage（ICH）.M ethods：In present study，200 SD rats were randomly divided into 4 groups：blank control，sham control，model and PNS treatmentgroups.ICH was induced by stereotactic injection of the collagenaseⅣinto the right caudate nucleus. PNSor saline was injected intraperitoneally once a day after ICH，and the neurologic impairmentwas assessed by nMSSmethod for 5 time points：6 h，24 h，48 hour，72 h and 7 d.Both content of serous fibrinogen（FIB）and Fibrinogen clotting time（FIBs）were measured.Results：The score ofmNSS increased from 6h（P＜0.05）following ICH，and peaked at 48h，then returned to the normal on the 7th day，and the PNS decreased cerebral water content significantly at every examined time points except for 6 h（P＜0.05）. Moreover，both serous FIB and FIBs increased obviously at48 h after ICH（P＜0.05）.The PNS inhibited the increase of both content compared with that inmodel group（FIB P＝0.017，TT P＝0.028）.Conclusion：In rats，the score ofmNSSstarted from 6h following ICH with a peak at 48 hours，and then decreased gradually，accompanied by the elevation of FIB and FIBs at48h.PNS can effectively alleviate the score ofmNSS via the inhibition of coagulation cascade pathway.

Cerebral hemorrhage（ICH）；Panax Notoginseng Saponins（PNS）；Thrombin；mNSS

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.024

北京中醫藥大學自主選題項目資助項目（編號：2013-JYBZZ-XS-154）；高等學校博士學科點專項科研基金（新教師類）資助課題（編號：2011001312001）；北京中醫藥大學科研創新團隊項目（編號：2011-CXTD-23）

陳志剛，男，北京中醫藥大學東方醫院，郵編：100078；Tel：010-67689776