日本藥局方“近紅外分光光度法”簡介

喬延江 薛 忠 徐 冰 戴勝云 吳志生 史新元

（北京中醫藥大學中藥信息工程研究中心，北京，100029）

中藥關鍵質量屬性快速評價研究專題

日本藥局方“近紅外分光光度法”簡介

喬延江 薛 忠 徐 冰 戴勝云 吳志生 史新元

（北京中醫藥大學中藥信息工程研究中心，北京，100029）

本文旨在翻譯并介紹《日本藥局方》（第16版）收載的近紅外分光光度法的相關內容，包括近紅外分光光度法的原理、方法、設備、以及其在定量和定性分析中的應用等，以期為我國更好的研究和應用近紅外光譜法提供有益參考。

日本藥局方近紅外分光光度法（NIRS）；定性定量分析；光譜儀

近紅外分光光度法（Near Infrared Spectrometry，NIRS）是一種快速無損的分析方法，已被中國、美國、日本、歐盟等多個國家和組織的藥典所收載，廣泛應用于制劑分析、化學分析、物理分析和過程分析等領域。為了更好的推廣和規范近紅外分光光度法，本文對《日本藥局方》（第16版）中“一般信息”項下收載的近紅外分光光度法進行了詳細的介紹，以期為我國近紅外分光光度法的研究和應用提供有益參考。

2010版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）二部附錄中收載了近紅外分光光度法指導原則，但與《日本藥局方》（第16版）收載的近紅外分光光度法相比存在以下幾點差異：1）《日本藥局方》介紹了近紅外光譜儀器的類型、組成及功能，《中國藥典》只簡單介紹了儀器的組成；2）《日本藥局方》中介紹了透射法、漫反射法、透反射法三種模式，而《中國藥典》中只介紹了透射法和漫反射法兩種模式；3）《日本藥局方》中更加詳細的介紹了影響近紅外光譜的主要因素，《中國藥典》只是簡單列出了影響因素；4）在近紅外定性定量應用方面，《中國藥典》介紹了定性定量應用的主要步驟，而《日本藥局方》強調了方法的驗證。

近紅外分光光度法是一種通過分析物質在近紅外范圍內對光的吸收產生的數據，來對物質進行定量定性評價的光譜方法。近紅外譜區位于可見光區和紅外光區之間，典型波長（波數）在750和2500 nm（13333～4000 cm-1）之間。近紅外光主要產生于來自含氫基團（如O-H，N-H，C-H及S-H）在紅外譜區（4000～400 cm-1）正常振動的倍頻或合頻吸收，例如N-H鍵不對稱分子伸縮振動發生在波數3400 cm-1附近，但是第一激發態的吸收發生在波數6600 cm-1（波長1515 nm）附近，將近兩倍于3400 cm-1。

近紅外光譜的吸收強度遠低于紅外光譜的基頻振動。此外，與可見光相比，近紅外光的波長更長，使得近紅外光能夠穿透包括顆粒在內的固體樣品幾毫米深。因此這種方法經常被用作無破壞的分析，在分析過程中光譜吸收（透射光或反射光）的變化可提供關于樣品的物理和化學信息。

傳統的光譜分析法，如校正曲線法，作為分析近紅外光譜吸收的方法是可行的。但是，一般采用化學計量學方法來分析。化學計量學方法一般涉及化學數據的定量，以及信息化、智能化的數值計算和統計分析步驟。適用于近紅外光譜分析的化學計量學方法涉及不同類型的多變量分析手段，如多變量回歸分析，用來完成活性物質的定性和定量評價。

近紅外分光光度法作為一種快速且無破壞性的分析方法，在進行水分測定和物質檢驗時，可以代替傳統的分析方法。在將近紅外分光光度法作為日常質量評價方法前，有必要將近紅外分光光度法和已有的分析方法進行比較，以驗證其和已有方法的等效性。

近紅外分光光度法在醫藥領域的應用包括成分、添加劑以及活性物質或制劑中水分含量的定量定性分析。此外，近紅外光譜法同樣可以用來對物質的物理性質進行分析，如晶型、結晶度、粒徑。近紅外光譜法能夠通過光纖實現遠程分析，而無需采樣，是一種有效的藥品生產過程的在線控制手段。

1 儀器設備

近紅外光譜儀包括色散型近紅外光譜儀和傅里葉變換型近紅外光譜儀［1］。干涉濾光片型近紅外光譜儀也是有效的，但是這種類型的儀器很難在藥物質量控制領域應用。

1.1 色散型近紅外光譜儀 儀器組成包括光源、樣品表達系統、分光系統、光度測定系統、信號處理系統、數據處理系統、顯示-記錄-輸出系統。鹵燈、鎢燈、光電二極管和其他這類能夠以固定模式發出高強度近紅外光的儀器用做光源。樣品表達系統由樣品室和樣品臺組成。設備的光纖部分由光纖和準直器組成，這部分的功能是傳遞光到樣品表達系統，可延長樣品表達系統與光譜儀之間的距離。光纖材料一般用石英做成。

分光系統是用色散元件將所需波長的光分出，由狹縫、反光鏡和色散元件組成。可用的色散元件包括棱鏡、衍射光柵、聲光可調濾波器（AOTF）和液晶可調濾波器（LCTF）。

光度測定系統由檢測器和放大器組成。傳感器包括半導體探測器（硅、硫化鉛、銦-鎵-砷、銦-銻）及光電倍增管。半導體檢測器可用來實現單點檢測或陣列檢測。陣列檢測器可以同時檢測多個波長（波數）。信號處理系統的功能是把測量需要的信號從放大器產生的信號中分離出來，并輸出這些分離的信號。數據處理系統完成數據轉換和光譜分析等功能。顯示-記錄-輸出系統輸出數據，分析結果并打印。

1.2 傅里葉變換型近紅外光譜儀 傅里葉變換型近紅外光譜儀的配置除了分光系統和信號處理系統外，其他部分與在1.1節中描述的色散型儀器基本上是一樣的。

分光系統由干涉器、抽樣信號生成器、探測器、放大器、A／D轉換器等組成。干涉儀包括邁克遜干涉儀、耳堂干涉儀和偏振干涉儀。信號處理系統除基本功能外，還可將獲取的干涉波采用傅里葉變換的方法轉換為吸收光譜。

2 測定

近紅外分光光度法有三種類型的測定方法：透射法、漫反射法和透反射法。測定方法的選擇是由樣品的形狀和應用需求決定的。透射法或漫反射法適用于固體樣品，包括細顆粒。透射法或透射反射法適用于液體樣品。

2.1 透射法 光源產生的入射光通過樣品后的光強的衰減程度用透射率T（%）或吸光度A來表示。樣品位于光源和檢測器的光路上，這種布置和典型的分光光度法是一樣的。

此方法適用于液體樣品的測量。檢測池為石英皿或流通池，光程為1～5 mm。此外，透射法同樣適用于包括細顆粒在內的固體樣品，又稱作漫透射法，選擇合適的光程對該方法至關重要，因為透射光強度的變化由樣品粒子的大小和表面條件決定。

2.2 漫反射法 在漫反射法中，樣品發散的反射光強度比I范圍很大，由物質表面發散的反射光強度Ir用R（%）表示。近紅外光可以穿透包括細顆粒在內的固體樣品數毫米深。在這個過程中，透射、折射、反射、散射重復發生，漫反射隨之產生，但一部分漫反射光從樣品表面再次發出并被檢測器捕獲。漫反射吸光度（Ar）的光譜一般能夠通過繪制反射率倒數的對數與波長（波數）之間的的關系曲線得到。

漫反射光譜的強度同樣可以用Kubelka-Munk（K -M）方程來表達。K-M方程的推導是基于樣品有足夠的厚度，用光的散射系數表示，而光的散射系數由吸光度、粒子大小、形狀和填充程度決定。

這種方法適用于包括細顆粒在內的固體樣品，但需要一個漫反射鏡。

2.3 透反射法 透反射法是透射法和漫反射法的組合。一面鏡子將通過樣品的反射光再反射，以此測定透反射率T*（%）。光程是樣品厚度的兩倍。另一方面，鏡子的反射光進入檢測器后可作為參比光。然而當透反射法應用于懸浮樣品時，應使用具有粗糙表面的金屬板或陶瓷反射器來代替鏡子使用。

透反射吸光度由下面的公式獲得：

此方法適用于包括細顆粒在內的固體樣品，也適用于液體和懸浮樣品。當應用于固體樣品時，樣品的厚度必須經過調整，一般調整吸光度在0.1到2（透光率79%～1%）之間，以提供最好的線性和檢測器的S／N比。樣品池的厚度取決于細顆粒的大小，應用前應進行考察。

3 影響光譜的因素

在應用近紅外分光光度法，特別是在進行定量分析時，以下是必須考慮的影響光譜的因素。1）樣品溫度：溫度變化幾度（℃）就會產生重大的變化（如波長漂移）。必須小心對待，特別是在樣品為液體或樣品含水的時候。2）水分或殘留溶劑：樣品中的水分或殘留溶劑會像環境中的水分（濕度）一樣，嚴重影響近紅外光譜的吸收帶。3）樣品厚度：樣品的厚度是光譜變化的影響因素之一，因此需要控制到確定的厚度。一定樣品厚度對漫反射法來說可能是適當的，但當厚度小于某個值時，如在進行透反射法測定時，此樣品就需要被放在一個具有高反射率的支撐盤上。4）樣品的填充條件：在測定固體或細顆粒樣品時，樣品的填充條件對光譜具有潛在影響。在向樣品池填裝固體樣品時，需采用合適的方法填裝確定量的樣品。5）樣品的光學特征：當樣品的物理、化學和光學特征不均衡時，必須用尺寸較大的光束，必須進行多個樣品的測量，對于同一樣品必須測定多個點，或將樣品粉末化以使樣品均一化。顆粒粒子大小、填充條件、以及表面粗糙程度都會影響樣品的測量。6）晶型：晶體結構（晶型）的變化會影響光譜。在多種晶型存在的條件下，必須考慮樣品的特征，保證用于校正曲線法的標準樣品和用于分析的樣品具有相似的分布。7）樣品特征隨時間的變化：在采樣以后由于時間的推移或是儲藏的原因，樣品的可能經歷化學、物理或光學的變化，而這些變化會在細微之處影響光譜。即使是相同的樣品，如果經過的時間不同，它們的近紅外光譜也會發生顯著的變化。因此，實驗室的測量工作必須在線下完成，制造過程的測量工作必須在線上完成，校正曲線法所用的樣品在測定之前必須充分考慮時間推移帶來的影響。

4 設備性能控制［2-3］

4.1 波長的準確度 設備的波長（波數）準確度取決于某物質特定吸收峰所對應的波長（波數）誤差，如聚苯乙烯、稀土氧化物混合物（鏑、鈥和鉺；1∶1∶1）或者水蒸氣等，可從設備上顯示的數據得出。通常將3個峰附近的容限值設置如下：

由于吸收峰位置的變化取決于物質所使用的參考物，所以吸收峰對應的波長與上面3個峰最接近的被選作適用性評價。例如，一個稀土氧化物的混合物在波長1261 nm、1681 nm和1971 nm處顯示其特征吸收峰。

當使用二氯甲烷作參比并采用透射法測量時，可以使用1155 nm、1417 nm、1649 nm和2352 nm（光程：1.0 mm）的吸收峰。在使用傅里葉變換型分光光度計時，可以使用7306.7 cm-1處的蒸汽吸收峰，因為此處具有較高的波長分辨率。

其他物質也可以用作參比物質，但它們必須得到充分的驗證。

4.2 光譜的線性 合適的標準板，比如具有不同濃度碳的板狀聚合物（碳摻雜聚合物標準），能夠評價光譜的線性。但是，為了保證線性，必須使用不低于4個濃度水平且反射比為10%～90%的標準板。當期望測量的吸光度不小于1.0時，就需要增加反射比為2%和（或）5%的標準板。

為了繪制這些標準板在波長1200 nm、1600 nm和2000 nm的吸光度（AOBS）與每個標準板的參比吸光度（AREF）之間的關系曲線，必須確保每個波長處的線性梯度在（1.0±0.05）范圍內，并且縱坐標截距在（0± 0.05）之間。

4.3 光譜光度噪音 采用合適的反射標準板，如白色反射瓷磚或反射式熱塑性樹脂（如聚四氟乙烯），可以檢查設備的光譜光度測量噪音。

4.3.1 高通量噪音 光譜光度噪音的評估是利用高反射比的標準板，比如99%的反射比。標準板用來測量樣品和對照樣品。通常，可在1200～2200 nm波長范圍內計算每100 nm間隔的噪音的均方根（RMS）的平均值，并規定該平均值不超過0.3×10-3，個體值不超過0.8×10-3。

4.3.2 低通量噪音 當光量低時，光譜光度噪音的評價可使用低反射比的標準板，如10%的反射比。這種情況下，光源、光學系統、探測器和電路系統都會對噪音產生影響。與高通量噪音相似，在1200～2200 nm波長范圍內，規定100 nm間隔內的噪音均方根的平均值不得大于1.0×10-3，個體值不得超過2.0×10-3。

5 定性定量分析的應用

與紅外光譜不同，近紅外光譜主要是倍頻峰和合頻峰。這些吸收光譜經常表現為分子官能團和原子基團吸收譜帶的疊加。因此，近紅外光譜法與傳統分析法存在差異，它通常需要建立與每個應用相對應的分析方法，并使用化學計量學方法，如多變量分析，來建立分析模型。

必須重視近紅外光譜的特征，必須采用數學預處理方法，如一階、二階導數或歸一化法，來減少光譜復雜性以及吸收譜帶的重疊，這些預處理方法對于通過化學計量學手段來建立分析方法有至關重要的作用。雖然有很多化學計量學方法和數學預處理方法可用來進行數據預處理，但是必須選擇適當的與預期分析目的相匹配的方法組合。

當建立一個近紅外分析方法時，需要結合分析參數進行方法有效性驗證，參數的選擇必須滿足應用的需要。此外，為適應近紅外光譜分析的需要，尚須考慮以下問題。1）在給定條件下，特定分析法中的波長（波數）是否適用于樣品特征的評價。2）方法是否足夠穩健，以應對來自樣品處理過程和樣品基質的變異。3）與已有的標準分析方法相比，是否能夠得到同樣水平的精度和準確度。4）分析方法一旦建立，其維護和管理至關重要。因此，必須開展持續的和系統的方法維護與檢查工作。此外，當生產過程或原料出現變化，或對設備的主要元件進行更換時，必須決定是否要采取變更控制或變更后的分析方法重驗證。5）若使用特定設備，當從原設備到另一臺設備進行模型傳遞時，應有合適的評價方法來確認分析方法傳遞的有效性。

5.1 定性分析 定性分析，如物質的鑒別，可在建立參比樣品庫后執行。參比樣品庫包括容許范圍內的批間變異，以及化學計量學方法，如多變量分析。此方法也可用來估計批次間的微小質量特征波動。

此外，多變量分析方法包括將波長（波數）和吸光度作為變量的直接分析法（如波長相關法、殘差平方和、范圍平方和），以及因子分析法、聚類分析法、判別分析法、SIMCA（軟獨立模式分類）法等。另外，也可以考慮把整個近紅外吸收光譜作為一種單獨的模式，并將通過多變量分析識別得來的參數，或將樣品物質的特征峰波長（波數）作為監控指標，來進行活性物質或制劑的生產過程控制。

5.2 定量分析 定量分析是通過化學計量學的方法，利用一組樣品的光譜和采用已有分析法測得的分析值，來建立定量關系模型，并通過定量模型來計算待測樣品組分的濃度和屬性值。可用來建立定量分析模型的化學計量學方法包括多元回歸分析法、主成分回歸分析法和偏最小二乘回歸分析法（PLS）等。

在樣品組分簡單的情況下，樣品中組分的濃度可通過校正曲線計算，該校正曲線表征特定波長（波數）的吸光度或參數和濃度之間的相關性，并使用已知濃度的樣品來繪制（校正曲線法）。

［1］General Rules for Near-infrared Spectrophotometric Analysis，JIS K 0134（2002），Japanese Industrial Standards.

［2］Near-infrared Spectrophotometry，2.2.40，European Pharmacopoeia 5.0（2005）.

［3］Near-infrared Spectrophotometry，＜1119＞，US Pharmacopoeia 30（2007）.

（2013-10-30收稿）

Introduction to Near Infrared Spectrometry in Japanese Pharmacopoeia

Qiao Yanjiang，Xue Zhong，Xu Bing，Dai Shengyun，Wu Zhisheng，Shi Xinyuan
（Research Center of Traditional Chinese Medicine Information Engineering，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

This paperwas aimed to translate and introduce the principles，methods，equipment，and applications to quantitative and qualitative analysis of near infrared spectrometry（NIRS）in the Japanese Pharmacopoeia the Sixteenth Edition，and to provide a useful reference for better research and application of Near Infrared Spectrometry in our country.

Japanese Pharmacopoeia；Near infrared spectrometry；Qualitative and quantitative analysis；Spectrophotometer

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.001

國家自然科學基金項目（編號：81303218）；2013年省部級“中藥基礎與新藥研究”重點實驗室開放課題資助

喬延江，博士，教授，博士生導師，Tel：（010）84738661，E-mail：yjqiao＠263.net

史新元，博士，副教授，碩士生導師。Tel：（010）84738621，E-mail：shixinyuan01＠163.com