增液湯干預(yù)干燥綜合征模型鼠AQP1／AQP8的表達(dá)規(guī)律研究

吳曉丹任長(zhǎng)虹張 林周洪偉程 涓楊 勇

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029；2首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京，100053；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700；4北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，101121）

增液湯干預(yù)干燥綜合征模型鼠AQP1／AQP8的表達(dá)規(guī)律研究

吳曉丹1任長(zhǎng)虹2張 林1周洪偉3程 涓4楊 勇1

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029；2首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京，100053；3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700；4北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，101121）

目的：觀察增液湯干預(yù)下干燥綜合征（Sjogren＇s Syndrome，SS）模型小鼠肺及結(jié)腸組織中水通道蛋白AQP1（aquaporin1）、AQP8（aquaporin8）的表達(dá)規(guī)律。方法：選用BALB／c小鼠，各組10只，免疫誘導(dǎo)法建立干燥綜合征小鼠模型，產(chǎn)生SS特異性臨床表現(xiàn)和病理改變，采用免疫組化和Western blot蛋白質(zhì)印跡法觀察增液湯對(duì)SS模型小鼠肺及結(jié)腸組織中AQP1／AQP8表達(dá)的影響。結(jié)果：增液湯可以增強(qiáng)肺及結(jié)腸組織中AQP1的蛋白表達(dá)（P＜0.01），對(duì)AQP8無(wú)影響。結(jié)論：AQP1在干燥綜合征模型鼠多組織中的表達(dá)下調(diào)，可能是干燥綜合征水液代謝障礙，多臟器損傷的機(jī)制之一；增液湯恢復(fù)機(jī)體陰液，起到“增水”功效可能與上調(diào)AQP1蛋白表達(dá)有關(guān)。

AQP1；AQP8；干燥綜合征；Western blot；增液湯

干燥綜合征（sjogren＇s syndrome，SS）是一種慢性自身免疫性疾病，以進(jìn)行性腺體分泌減少為主要臨床表現(xiàn)，同時(shí)會(huì)累及身體多臟器出現(xiàn)炎性改變及功能受損。水通道蛋白的表達(dá)減少是干燥綜合征重要的發(fā)病機(jī)制之一［1］，為驗(yàn)證增液湯對(duì)干燥綜合征患者的整體治療作用，有必要觀察其是否能通過(guò)調(diào)節(jié)水通道蛋白表達(dá)而減輕干燥綜合征模型的多臟器水液代謝障礙。因此本研究采用免疫組化和Western blot蛋白質(zhì)印跡法，探索性地觀察增液湯對(duì)SS小鼠模型肺及結(jié)腸組織AQP1和AQP8表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用BALB／c小鼠50只，雌性，SPF級(jí)，8～10周齡，體質(zhì)量20 g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證：SCXK（京）2012-0001。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫（20±2）℃，濕度55%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 AQP1抗體（abcam公司，批號(hào)：ab11025）；AQP8抗體（sigma公司，批號(hào)：WH0000343M1）；弗氏完全佐劑；Tripure蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（南京建成生物工程研究所，20110510）；二甲苯（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，20120822）；蘇木素染色液、伊紅染色液（天合力恩化學(xué)試劑，20120907，20120603）；石蠟；中性樹(shù)脂；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；百白破聯(lián)合疫苗（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，20111258-2）。增液湯藥物（生地黃、玄參、麥冬）購(gòu)自北京同仁堂藥店，依據(jù)新版藥典規(guī)定HPLC測(cè)定藥物成分；水煎液組上藥加8～10倍水浸泡30 min，煎煮2次，每次40 min，合并濾液，濃縮成1∶1藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時(shí)用蒸餾水配成40%溶液。重組人干擾素α2b注射液（北京凱因科技股份有限公司，20110571）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 ASP300自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；RM2135切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；EG1140H石蠟烤片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；BX60顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SPOT-Ⅱ圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)diagnostic instruments Inc.）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)，Beckman）；Dolphin-View凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)，Wealtec）；分光光度儀；-70℃低溫冰箱；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置。

1.4 動(dòng)物模型的建立 選用BALB／c小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，模型組及給藥各組分別注射百日咳疫苗+完全弗氏佐劑+同種鼠下頜下腺抗原（200μg／mL），多點(diǎn)注射于小鼠足墊、背部皮下，總量為0.5 mL，腹部注射百日咳疫苗0.05 mL；佐劑組注射CFA，0.1 mL／只腳掌；空白對(duì)照組不作任何處理。觀察35 d后造模各組出現(xiàn)飲水量增加，唾液流率減少等SS特異性病變后，中藥組開(kāi)始每日灌服增液湯（0.2 mL／10 g）；空白組灌服與中藥等體積蒸餾水；干擾素組腹腔注射重組人干擾素α2b注射液。各組給藥15 d后，小鼠脫頸椎處死，立即取肺及結(jié)腸組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察；免疫組化檢測(cè)AQP1、AQP8的定位表達(dá)；其余標(biāo)本置于-70℃冰箱中備用，作Western blot蛋白質(zhì)印跡分析。

1.5 免疫組化研究 取出組織冷凍切片，0.1 mol／L PBS洗滌5 min×2次；置于0.3%甲醇過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育20 min；PBS浸泡5 min，加封閉血清1 h；加一抗（AQP1、AQP8抗體稀釋度分別為1∶500和1∶400），37℃孵育1 h；PBS洗5 min×3次，加生物素化兔抗山羊IgG，37℃孵育1 h；PBS洗5 min×3次，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育1 h；PBS洗5min× 3次，DAB顯色、沖洗、封片。對(duì)照設(shè)置：不加一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：棕黃或棕褐色顆粒判定為陽(yáng)性。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%、未被染色為陰性，計(jì)0分；5%～15%、淺棕色為弱陽(yáng)性，計(jì)1分；15%～25%、淺棕色為中陽(yáng)性，計(jì)2分；＞25%棕色為陽(yáng)性，計(jì)3分。

1.6 Western blot蛋白質(zhì)印跡分析

1.6.1 組織總蛋白提取 稱取-70℃冰箱保存的各組標(biāo)本100 mg，分別置于5 mL離心管中，各加入1 mL Tripure裂解液，以Lowry法測(cè)定蛋白濃度，轉(zhuǎn)移上清置于-20℃冰箱備用。

1.6.2 蛋白定量 1）制定標(biāo)準(zhǔn)曲線：將中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋如下：0、50、100、150、200和250μg／mL，各取200μL，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度、吸光度值為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2）測(cè)樣本濃度：將提取的蛋白溶液25μL稀釋8倍至200μL，得到相應(yīng)的吸光度值。將待測(cè)標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的濃度，乘以適當(dāng)稀釋倍數(shù)即為樣本濃度。

1.6.3 蛋白質(zhì)印跡測(cè)定方法和步驟 分別取樣本提取液并加上樣緩沖液各15μL混合，取標(biāo)準(zhǔn)蛋白加200 μL上樣緩沖液，煮沸5 min；加樣（提取液加入總蛋白30μg，標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入5μg），緩沖液封閉，60 V電壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳5 h；轉(zhuǎn)膜；15 V電壓轉(zhuǎn)膜40 min；將PVDF膜置于1%BSA中封閉，4℃冰箱中過(guò)夜；倒出1% BSA后，加一抗（AQP1、AQP8稀釋度均為1∶1000）置于37℃中1 h；PBS洗滌5 min×3次，加生物素化兔抗羊IgG3μg／mL，37℃搖床1 h；PBS洗滌5 min×3次，加辣根素標(biāo)記鏈親合素3μg／mL，37℃搖床1 h；DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較使用Student t test，以P＜0.05和P＜0.01均表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增液湯對(duì)SS模型病理組織學(xué)影響

圖1 腸組織病理學(xué)改變

圖1中空白組結(jié)腸組織無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，形態(tài)正常；SS模型鼠結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，灶片狀淋巴組織增生；增液湯組結(jié)腸固有層僅有散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 肺組織病理學(xué)改變

圖2中空白組肺組織形態(tài)基本正常；SS模型肺組織出現(xiàn)輕度胸膜炎，周圍肺組織出現(xiàn)重度間質(zhì)炎，部分出現(xiàn)肺氣腫表現(xiàn)；增液湯組上述病理改變明顯減輕。

2.2 增液湯對(duì)SS模型免疫組化的影響

2.2.1 SS模型肺組織AQP1免疫組化結(jié)果

圖3 -8 肺組織AQP1免疫組織化學(xué)結(jié)果

圖9 -11 結(jié)腸組織AQP1免疫組織化學(xué)結(jié)果

圖5顯示SS模型肺泡及毛細(xì)血管AQP1表達(dá)減少，與空白組（圖3）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；佐劑組與干擾素組（圖4、圖6）AQP1表達(dá)略有增強(qiáng)，與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；增液湯組（圖7、圖8）AQP1分布均勻，與空白組比較表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。

2.2.2 SS模型結(jié)腸組織AQP1免疫組化結(jié)果

增液湯組（圖11）AQP1分布均勻，表達(dá)較空白組（圖9）增強(qiáng)（P＜0.05）；模型組（圖10）表達(dá)未見(jiàn)增強(qiáng)，與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.3 SS模型肺及結(jié)腸組織AQP8免疫組化結(jié)果

圖12 -17 肺及結(jié)腸組織AQP8免疫組織化學(xué)結(jié)果

如圖12-17所示，AQP8在肺及結(jié)腸組織的表達(dá)明顯，分布均勻，但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖18 （1空白組；2模型組；3佐劑組；4干擾素組；5增液湯組）

圖19 （1空白組；2模型組；3佐劑組；4干擾素組；5增液湯組）

2.3 Western blot印跡分析 采用Western blot印跡分析，結(jié)果顯示與免疫組化基本一致（圖18、圖19）。在肺組織中，與模型組（灰度值0.785±0.182）比較，增液湯組AQP1（灰度值3.795±0.634）表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；AQP8各組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)腸組織中，與模型組（灰度值0.925±0.326）比較，增液湯組AQP1（灰度值4.227±1.032）表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；AQP8增液湯組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

增液湯在《溫病條辨》中治療溫病后期，津虧腸燥證。基于中醫(yī)理論思考分析，溫病首先犯肺，肺為水之上源，通調(diào)水道，輸布水液，且肺與大腸相表里，所以溫病發(fā)熱會(huì)導(dǎo)致肺運(yùn)轉(zhuǎn)水液功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致腸道津液虧竭。本項(xiàng)目主要探索增液湯對(duì)干燥綜合征模型水通道蛋白的調(diào)節(jié)規(guī)律，進(jìn)而證明增液湯對(duì)干燥綜合征患者的整體治療作用。結(jié)合本方主治證及臟腑表里關(guān)聯(lián)性，對(duì)肺及結(jié)腸組織中水通道蛋白AQP1及AQP8進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，增液湯干預(yù)下AQP1在肺泡毛細(xì)血管間及腸上皮細(xì)胞表達(dá)，與模型組比較表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。AQP8在肺及結(jié)腸組織的表達(dá)明顯，分布均勻，但各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），western blot結(jié)果與免疫組化趨同。Towne等［2］發(fā)現(xiàn)，小鼠急性肺部腺病毒感染后7～14 d，肺組織中AQP1的表達(dá)均顯著減少，說(shuō)明AQP1與肺組織水液運(yùn)轉(zhuǎn)具有相關(guān)性。在近20年的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了水通道家族（aquaporins，AQPs）中的13種亞型（AQP0-AQP12）［3］。AQP1是在人體分布最廣泛的水通道蛋白，在機(jī)體的各個(gè)組織廣泛表達(dá)，提示其在維持體內(nèi)水平衡過(guò)程中起重要作用［4］。如果AQP1是增液湯的用靶點(diǎn)，說(shuō)明增液湯“增水行舟”非獨(dú)潤(rùn)腸，可同時(shí)參與全身多組織的津液調(diào)節(jié)［5］。同時(shí)，肺與結(jié)腸組織中AQP1的相關(guān)性，是否為“肺與大腸相表里”的聯(lián)接靶點(diǎn)之一，尚需進(jìn)一步通過(guò)研究驗(yàn)證。我們的研究明確了養(yǎng)陰中藥作用于機(jī)體的靶點(diǎn)，并深入闡釋了“增水行舟”的內(nèi)涵。

［1］Steinfeld S，Cogan E，King LS，et al.Abnormal distribution of aqparin-5 water channel protein in salivary in glands from Sjogren’s syndrome patients［J］.Lab Invest，2001，81（2）：143-148.

［2］Towne JE，Harrod KS，Krane CM，et al.Decreased Expressionof aquaporin AQP1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22：34-44.

［3］Castle NA.Aquaporins as targets for drug discovery［J］.Drug Discovery Today，2005，10（7）：485.

［4］譚美蕓.水通道AQP1的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（9）：241-243.

［5］吳曉丹，孫麗英，馬伯艷.《溫病條辨》增液湯功效探析［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（6）：351-352.

（2013-07-17收稿）

Intervention of Zengye Decoction on Expression of Aquaporin-1，8 in the Mice w ith Sjogren’s Syndrome

Wu Xiaodan1，Ren Changhong2，Zang Lin1，Zhou Hongwei3，Cheng Juan3，Yang Yong1
（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China；3 China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；4 Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 101121，China）

Objective：To observe the expressions of AQP1 and AQP8 in lung and colon tissue ofmice with Sjogren＇s syndrome.Methods：Fifty BALB／cmice were randomized into five groups，with10 mice in each group.Themicemodelswith Sjogren＇s syndrome were established by immune inducingmethod.Itwas able to produce the specific clinical symptoms and pathological changes of Sjogren＇s syndrome.The effect of Zengye decoction on the expression of AQP1／AQP8 in lung and colon tissuewas observed by immunohistochemistry and Western blot.Results：Zengye decoction can strengthen the AQP1 protein expression in lung and colon tissue（P＜0.01），however AQP8 was barely changed.Conclusion：It could be one of the causes of Sjogren＇s syndrome that AQP1 expression was reduced inmultiple organ in themice with Sjogren’s syndrome.Zengye decoction can increase the body fluid，and the effectmay be associated with the increased AQP1 expression.

AQP1；AQP8；Sjogren＇s syndrome；Western blot；Zengye decoction

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.12.026

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81001495／H2705）

楊勇（1971—），男，北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系副教授，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：歷代名醫(yī)組方思想及名方配伍的理論與實(shí)驗(yàn)研究

吳曉丹（1978—），女，北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系講師，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：方劑配伍規(guī)律及療效客觀化研究