枸杞多糖對新生鼠氯化甲基汞慢暴露染毒致成年期生育能力下降的干預作用

曹 池劉 香陳海斌羅 邁崔 靜張 華王米佳王 丹田建英

（1寧夏醫科大學基礎學院，銀川，750004；2寧夏自治區人民醫院神經內科，銀川，750004）

枸杞多糖對新生鼠氯化甲基汞慢暴露染毒致成年期生育能力下降的干預作用

曹 池1劉 香1陳海斌1羅 邁1崔 靜1張 華2王米佳1王 丹1田建英1

（1寧夏醫科大學基礎學院，銀川，750004；2寧夏自治區人民醫院神經內科，銀川，750004）

目的：探討早期低劑量接觸氯化甲基汞（Methyl Mercury Chloride，MMC）對大鼠生殖功能和生長發育的影響以及枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）的早期干預。方法：將60只健康7日齡大鼠隨機分為對照組（CON）、MMC組、MMC +LBP組、LBP組，MMC組和MMC+LBP組均頸部皮下注射MMC，CON組頸部注射相同劑量的生理鹽水，MMC+LBP組同時喂養LBP，雌雄合籠，自然觀察各組體重發育以及生殖繁育能力以及子代仔鼠早期生長發育和存活狀況。再將已孕母鼠哺乳期仔鼠染毒，觀察母鼠產仔情況。結果：1）MMC組毛色萎縮，精神狀態倦怠、動作不活潑、食欲不振。2）MMC組生長較緩慢且隨染毒時間的延長而明顯。3）MMC組染毒大鼠未產仔，MMC+LBP組有產仔，但產死率高、出生后存活率低于CON；LBP組產死率較CON低。4）MMC+LBP組有畸胎，且仔鼠出生體重與正常CON和LBP組仔鼠出生體重有統計學意義（P＜0.01）。5）染毒仔鼠影響其已孕母鼠再次生育。結論：MMC對大鼠有生殖發育毒性，LBP可抑制MMC引起的生殖毒性。

氯化甲基汞；枸杞多糖；生殖毒性

環境污染對生育力的影響引起越來越多的人關注。氯化甲基汞（MMC）是嚴重危害人類健康的蓄積性環境污染物，在食物鏈中有生物放大作用。存在于環境中的MMC對健康造成的影響主要表現為低劑量、長期暴露引起的非典型性、多系統的損傷。研究發現MMC對雄鼠的生殖能力可通過父系傳播影響后代的生長發育和神經行為發育的變化［1］。枸杞多糖（LBP）是枸杞子的主要功能成分之一，具有多種藥理作用和生物活性功能，其對生殖系統的保護作用亦有報道［2-4］，但是否能對MMC引起的生殖毒性有抑制作用尚未見報道。本實驗通過LBP對新生鼠長期接觸低劑量MMC導致其成年生殖毒性的干預作用觀察，旨在為尋求抑制MMC的生殖毒性，減少對新生兒，青少年生長發育的危害新的早期干預途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑MMC（德國Merck公司）；LBP（上海康舟真菌多糖有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 5～7 d健康二級清潔SD大鼠新生鼠60只（寧夏醫科大學實驗動物中心提供），體重9～12 g，動物房內清潔，噪音小于70 db，日光輔助照明，12 h／d，飼養溫度為（22±2）℃。飼料為寧夏醫科大學動物實驗中心提供。適應性飼養3 d，隨機分為4組，每組15只。MMC組（15只）：頸部皮下注射MMC造模；MMC+LBP組（15只），哺乳式喂養LBP（25 mg／mL），同時頸部皮下注射MMC；LBP組（15只）：只哺乳式喂養LBP；CON組（15只）：頸部皮下注射生理鹽水。

1.2.2 體重增長量測定 各組體重增長量的計算方法為，給藥10 d、20 d、30 d、40 d和50 d大鼠的體重增長，計算公式為：體重增長量＝（各時期體重-給藥前體重）。

1.2.3 各組雌鼠分娩率和產仔情況的觀察 觀察交配雌鼠分娩和產仔情況，記錄各組雌鼠的分娩率，產仔數、畸胎數、成活率等，如果該組雌鼠不產仔這些指標都按0計算。

1.2.4 仔鼠出生體重和早期生長發育觀察 記錄各組仔鼠出生體重，分別記錄各組仔鼠出生后耳廓分離時間、毛發長出時間、開眼的時間和自主采食時間，并進行各組之間的比較。如果該組雌鼠未產仔，各項指標都按0計算。

1.2.5 仔鼠染毒對正常雌鼠產仔數的影響 選產仔的正常雌鼠若干只，其產仔后，再次受孕，哺乳期間，仔鼠與孕鼠不分籠，仔鼠隨機分別標記，并給注射上述劑量的生理鹽水、MMC、MMC+LBP，28 d，各組換墊料、給食、給水時間一致，觀察記錄受孕雌鼠二胎產仔情況。

2 結果

2.1 一般狀況 與生理鹽水CON相比，MMC組進食量較少、體重減輕，糞便較稀，墊料潮濕，毛色發黃，運動遲緩，精神萎靡、有個別個體顯得較為暴躁；MMC+ LBP組體重、糞便、毛色、運動、精神等情況較MMC組減輕，較CON加重。

2.2 體重變化量 與CON相比MMC組和MMC+LBP組發育過程中體重增長緩慢，且隨著時間的延長而明顯，在給藥20～40 d期間，生長速度減慢最明顯，MMC+ LBP組大鼠隨LBP給藥時間延長體重增加，較MMC組差異有統計學意義（P＜0.05），由表1、表2可見。

2.3 MMC和LBP對大鼠生育能力的影響 MMC組分娩率零，MMC+LBP組雌鼠有分娩率，但產死率高，出現畸胎；CON組和LBP組雌鼠分娩率沒有明顯差別、存活率高且無畸胎，由表3可見。

表1 MMC和LBP對雄鼠體重增長的影響（n＝8，±s）

表1 MMC和LBP對雄鼠體重增長的影響（n＝8，±s）

注：與CON相比，**P＜0.01；與MMC組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別CON MMC MMC+LBP LBP 10 d 40.1±0.8 37.5±1.1**38.8±1.3 39.9±1.5 20 d 103.2±5.4 67.1±8.0**75.4±12.0**△102.1±3.9△△30 d 175.6±5.6 143.0±4.1**148.6±4.1**△179.1±3.6△△40 d 196.3±2.5 177.9±5.9**186.5±8.2**△199.4±7.7△△50 d 299.0±5.1 230.3±7.4**238.3±6.0**△297.1±7.0△△

表2 MMC和LBP對雌鼠體重增長的影響（n＝8，±s）

表2 MMC和LBP對雌鼠體重增長的影響（n＝8，±s）

注：與CON相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與MMC組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別CON MMC MMC+LBP LBP 10 d 27.3±2.8 26.0±2.1 26.0±1.6 26.5±2.5 20 d 71.5±1.5 61.4±1.5**63.8±0.9**70.4±1.1△△30 d 101.9±9.7 72.0±5.1**75.5±7.1**97.5±12.9△△40 d 143.8±5.1 129.8±6.0**136.3±4.9*△147.1±7.1△△50 d 163.5±5.2 145.9±5.2**155.1±4.1*△166.9±3.7△△

表3 MMC和LBP對雌鼠分娩、產仔情況的影響

2.4 LBP對MMC染毒親代產仔早期發育的影響 與CON比較，MMC+LBP組仔鼠出生體重與CON仔鼠出生體重都有統計學意義（P＜0.01）；耳廓分離時間沒有統計學意義（P＞0.05），毛發長出時間、開眼時間和自主采食時間明顯延長（P＜0.05）。LBP組仔鼠各項指標與CON沒有統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 仔鼠早期發育情況（n＝8，±s）

表4 仔鼠早期發育情況（n＝8，±s）

注：與CON比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別CON MMC+LBP LBP 6.09±0.21耳廓分離時間（d） 4.9±0.8 5.2±0.8 5.1±0.6毛發長出時間（d） 5.3±0.5 5.9±0.7* 5.4±0.5開眼時間（d） 12.6±0.7 13.9±1.1* 13.3±1.0自主采食時間（d） 15.9±0.8 16.6±0.7*出生體重（g） 6.26±0.36 4.93±0.22**16.2±0.8

CON和LBP組仔鼠體長較長，體型較大，膚色紅潤有光澤，仔鼠膚色紅潤有光澤，MMC+LBP組仔鼠皮膚失去光澤，顏色呈暗紫色，并且有畸胎，其死胎呈黑色。

2.5 哺乳期仔鼠染毒對已孕母鼠生育能力的影響健康母鼠產仔后再次受孕，觀察仔鼠染毒對母鼠的再次生育的影響，結果未染毒組母鼠產仔數均數為12只，MMC+LBP組產仔數為6只，MMC染毒組雌鼠未產仔。

圖1 仔鼠染毒對已孕母鼠生育能力的影響

3 討論

汞廣泛存在于自然界中，在水和土壤中微生物甲基化作用下生成劇毒MMC，對環境及人體健康都具有極大的危害，被各國政府及UNEP、WHO等國際組織列為“優先控制的環境污染物”［5］。由于其環境中最穩定，具有生物體內高蓄積性［6］，脂溶性高，易于通過胎盤屏障和血腦屏障，極易造成對發育期的器官的損害，特別是對發育期的腦更敏感。MMC可影響神經細胞凋亡、引起生物膜和神經遞質的改變。對兒童可有視覺、聽覺，神經行為改變［7-8］。孕期汞暴露、可損害子鼠長期記憶，延遲神經系統發育相關基因的表達，引起結構功能變化［9-11］。

MMC是生活中常見的不易分解的蓄積性環境污染物，可通過食物鏈進入體內。其可以通過胎盤直接造成對胎兒的損傷，也可對卵細胞造成遺傳損傷從而危害子代。吳美琴［12］等人研究發現汞可蓄積在人胎盤移出物中，具有明顯的劑量-反應關系，這種蓄積作用可能會影響到胎盤的組織結構，甚至干擾胎盤的正常生物轉化作用；也能透過血睪屏障，作用于雄性生殖系統，影響雄性動物的交配能力，作用于雄性生殖細胞dNA，造成遺傳損傷從而影響子代生長發育［13］；Sitarek等研究發現，低劑量接觸MMC對體重、耳廓分離、開眼時間等有顯著影響［14］。

LBP是傳統名貴中藥枸杞子的重要有效成分，是從枸杞子中提取而得的一種水溶性多糖。已明確該多糖系蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成，具有多種藥理作用和生物活性功能，主要藥理作用有：調節機體免疫功能、增強記憶力、抗氧化、耐缺氧、防輻射等［15-17］。現代科學研究表明，其具有免疫調節、抗氧化［18-19］，抑制Aβ誘導對原代神經元的毒性作用，盡管國內外尚少見關于LBP對抗環境污染，發揮保護作用的研究。有研究表明LBP能抑制微量MMC誘導的海馬神經干細胞的損傷［20］，明顯減輕溫水浴導致的大鼠睪丸組織細胞的損傷程度。可顯著改善大鼠交配能力，調節血清性激素水平的分泌。

本研究分別發現雌、雄鼠早期染毒，對其生長（體重增長量）、生育能力、和其仔鼠早期發育均有不良影響，結果顯示MMC染毒鼠生長較CON緩慢、精神狀態較差，長期染毒可致不孕不育，而MMC+LBP干預組雌鼠受孕分娩率明顯有所改善。對親代染毒后子代仔鼠早期發育狀況進行觀察發現MMC+LBP組仔鼠出生體重明顯低于正常CON仔鼠出生體重（P＜0.01），其毛發長出時間、開眼時間和自主采食時間與CON和LBP組有顯著差異，但耳廓分離時間未見顯著差異。CON和LBP組生育能力及其仔鼠早期發育未見顯著差異性，表明LBP在一定劑量范圍內，未見不良作用，并能全面改善MMC染毒鼠的生殖發育健康狀況，另，發現已受孕的正常母鼠哺乳染毒仔鼠，可使其終止妊娠，不生育。有研究表明體內攝入的汞可以隨代謝產物隨尿液、糞便排出體外，母鼠可能接觸到仔鼠毛，尿液以及糞便中的汞而染毒，可致其終止妊娠；MMC+ LBP組，母鼠有生育，且仔鼠能存活，表明LBP有保護染毒鼠的生育能力。通過篩選天然藥效成分，研究其對環境因素慢性暴露引起的發育和生殖的損傷后干預作用，將為預防環境污染提供了新的途徑，也為枸杞對抗環境污染，提供了理論依據。

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（2013-05-12收稿）

The Intervention Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on Adulthood Lower Fertility Reproduction Induced by Neonatal Exposed to Methylmercury Chloride in Rats

Cao Chi1，Liu Xiang1，Chen Haibin1，Luo Mai1，Cui Jing1，Zhang Hua2，Wang Mijia1，Wang Dan1，Tian Jianying1
（1 Basic School of Medicine，Ningxia Medical University，Yingchuan 750004，China；2 Department of Neurology，Ningxia Autonomous People′s Hospital，Yingchuan 750004，China）

Objective：To detect the toxicity of neonatal exposed tomethylmercury chloride on the adulthood reproduction，aswell as early growth and development in rats and the intervention of Lycium barbarum polysaccharide.Methods：Sixty SD of7 d ratswere randomly divided into saline Control，MMC，MMC+LBP，LBP.The natural development，weight growth and fertilities were observed.Healthy pregnant female rats and MMC exposed neonatal rats and were also observed.Results：1）Compared with the control group，the rats in MMC group was dropping，inactivity，loss of appetite；2）Theweights of rats in MMC group grew slower than in control ratswith the exposure time dependently；3）MMC group were infertility after exposure to themethylmercury.There remained offspring in MMC+LBP group and their after-born death rateswere higher than that of the control group，with low birth weights and low survival rates；4）The weights in MMC+LBP ratswere significant lower（P＜0.01）than that in in control and LBP group；5）The MMC exposed pups influenced the next reproduction of the female rats.Conclusion：Methylmercury chloride has developmentand reproductive toxicity effects on rats.Lycium barbarum polysaccharides have potential protection against the toxicity roles.

Methylmercury chloride；Lycium barbarum polysaccharide；Reproductive toxicity

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.12.029

國家自然科學基金（編號：81060231，81160338）；寧夏高校科技研究重點項目（編號：NGY2011039）

田建英，E-mail：jianyingt＠hotmail.com