急性精神應激對SD大鼠部分腦區BDNF及CREB表達的影響

李功迎 馬洪霞

（濟寧醫學院山東省行為醫學重點實驗室；濟寧醫學院護理學院，山東 濟寧272067）

隨著社會競爭的日益劇烈，應激（或稱壓力，stress）無處不在。應激分為生理應激（也稱軀體應激）和心理應激（也稱精神應激）。目前，精神應激對于個體而言是更有意義、更值得研究的問題，因為這種應激普遍存在于我們的現實生活中，而包含對軀體刺激的生理應激或純粹的軀體應激不能很好地模擬現實生活中人類所面臨的心理壓力或應激［1］。正如一些人目睹了一些應激事件（如目睹車禍、恐怖事件等），本身未經受任何軀體損傷，但過后一部分人會出現心理或精神障礙。

大量研究證明，機體處于應激狀態時，可以引起一系列神經生化、神經內分泌和免疫系統的變化，影響機體內環境的平衡，引起器官功能改變，也會導致機體產生腦結構和功能的可塑性改變［2－5］。腦源性神經營養因子（Brain－derived neurotrophic factor，BDNF）作為一種對多種神經元具有促進分化和再生、增強功能表達及營養、支持、保護作用的堿性蛋白［4］，最近有證據表明BDNF與應激、突觸可塑性密切相關。但其在精神應激中具體發揮了什么樣的作用？其發揮作用的機制是什么？這些問題尚不清楚。

本文選取“旁觀電擊大鼠應激模型（Communication Box）”［1，6］這一被認為“純精神應激”的模型，通過采用免疫組化技術，觀察精神應激后海馬CA1區、前額葉皮質（prefrontal cortex，PFC）、杏仁核中央核（central amygdaloid nuclei，AG）、伏隔核（殼區）（shell of accumbens nucleus，NAC）、中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray，PAG）、腹側背蓋區（ventral tegmental area，VTA）內BDNF、CREB不同時點表達的可塑性變化，探討BDNF對精神應激有無保護作用，以及其保護作用是否通過激活CREB途徑實現。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，由中南大學湘雅二醫院動物實驗中心提供，進入實驗時的體重為180～220g。實驗動物于實驗開始前一周，飼養于晝夜節律12／12h（8AM～8PM）、通風良好的動物房。環境溫度控制在22～24℃，動物均能自由飲水和進食。

1.2 實驗器材

旁觀電擊大鼠應激箱（Communication Box）［1，6］：箱子規格為60cm×60cm×44cm（長×寬×高），箱子四壁由木板做成，其“地板部分”由平行的不銹鋼柱（直徑：5mm；相鄰兩個不銹鋼柱的圓心之間的距離為1cm）組成，這些不銹鋼柱與220V電源相連，加一可變電阻，保證電流為1.5～2.2mA，并有一手控裝置，能隨時中斷或接通電源。箱內由比較堅硬透明的有機玻璃平均分成9個相同的單元格，每個單元格長×寬×高為20cm×20cm×44cm，箱內每個有機玻璃板距離“地板”6cm處有一直徑2cm圓孔。最中間單元格內的地板是通電的，其內放置的SD大鼠，接受電擊，為生理應激鼠（senders rat），最中間單元格的四周單元格的地板是絕緣的，其內放置的SD大鼠，不接受電擊，而是旁觀生理應激鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺、味覺等而產生精神應激，稱為精神應激鼠（responders rat）。精神應激鼠本身在軀體上不接受電擊，軀體沒受到任何損傷，因此這個模型可以較好地用來研究精神應激問題。

1.3 實驗方法

共分為2組：精神應激組（PS組）、空白對照組（Control組）。精神應激組（PS組）根據觀察的時間點分為應激后即刻、應激后0.5h、1h、2h、6h、24h 6小組，每組6只SD雄性大鼠，均為隨機分組。另有5只老鼠用來交替作生理應激鼠，共47只鼠。

1.3.1 應激方法 在旁觀電擊大鼠模型箱內，生理應激組大鼠接受電擊，電流為1.5～2.2mA，周期5s，間歇55s，產生驚叫、驚跳、大小便失禁等反應；精神應激組不接受電擊，而是旁觀生理應激鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺、味覺等產生精神應激。每次應激在上午8∶00—9∶00進行，每次持續1h，每日1次，共進行2d。而空白對照組不接受任何應激。

1.3.2 動物處理 每組接受應激后，根據時間點，腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg／kg體重）麻醉，胸腹腔聯合切開，暴露心臟，經左心室插管于升主動脈，剪開右心耳，先用無菌生理鹽水150ml快速灌注，直至流出液清亮。然后用4%多聚甲醛250ml以先快后慢原則灌注固定30min，取腦并將腦組織置于相同固定液中后固定2h（4℃），再放入30%蔗糖液中直至沉底。恒冷冰凍切片機－20℃下連續冠狀切片，片厚30μm，參照大鼠解剖圖譜，留取含海馬CA1區、PF、AG、NAC、PAG、VTA等以上各腦區的切片。

1.3.3 免疫組化 本研究中免疫組化均是按ABC法進行，具體的試驗步驟：1%H2O2處理切片30min，0.01MPBS漂洗5min×3次，室溫下正常山羊血清封閉1h并振蕩，分別加相應一抗（BDNF一抗工作液濃度為1／1000；磷酸化CREB一抗工作液濃度亦為1／1000），4℃孵育過夜。0.01M PBS漂洗5min×3次，分別加生物素化的二抗（1／100），2h后0.01MPBS漂洗5min×3次。加ABC復合物（1／100），室溫下反應2h，0.01MPBS漂洗5min×3次，DAB顯色（DAB 0.03%，H2O20.01%，0.01MPBS配制），顯微鏡下控制反應，顯色滿意后0.01MPBS充分漂洗終止反應。貼片，常規脫水透明、中性樹膠封片。陰性對照是以正常山羊血清取代一抗，其余步驟不變。

1.4 圖像分析

每組每只動物隨機選取含有各靶區的原位雜交染色切片與免疫組織化學染色切片各4張，每張切片隨機選取4個視野。使用Motic病理圖像分析系統（廈門麥克奧迪實業集團有限公司）測量陽性神經元的平均灰度值。切片陽性區表達的強弱與灰度值呈負相關，灰度值大則陽性表達弱，反之亦然。

1.5 統計學方法

所有的試驗結果除非特殊說明，均以±s表示。多組均數間的比較，采用方差分析（ANOVA），兩均數之間的比較采用獨立樣本t檢驗。所有的統計分析均采用SPSS11.5軟件包完成。

2 結果

2.1 精神應激組BDNF在各被檢腦區內不同時點的表達

由圖1A－F可看出，精神應激后即刻各腦區BDNF表達明顯下調，灰度值明顯大于對照組，差異具有極顯著性；精神應激后0.5h、1hBDNF表達開始恢復，但仍少于對照組，差異有顯著性；精神應激后2hBDNF表達除VTA區外，其余各腦區恢復至對照組水平，兩組比較無明顯差異；精神應激后6hBDNF表達繼續增高，明顯高于對照組（VTA區除外），差異有顯著性；精神應激后24h BDNF mRNA表達達最高值，明顯高于對照組，差異有顯著性（VTA區除外，VTA區表達仍低于對照組）。

圖1 應激后不同時刻精神應激組與正常對照組BDNF蛋白在各腦區表達的灰度值

2.2 精神應激組磷酸化CREB在各被檢腦區內不同時點的表達

由圖2可看出，在應激后即刻，精神應激組CREB灰度值較對照組明顯增大，差異具有顯著性，說明應激后即刻精神應激組CREB明顯低表達，較對照組表達明顯減少。隨后表達逐漸增多，精神應激后24h時，精神應激組CREB灰度值較對照組明顯減小，差異具有顯著性，說明應激后24h時，精神應激組CREB明顯高表達，較對照組表達明顯增多。

圖2 免疫組化檢測精神應激組P－CREB在各被檢腦區內不同時點的表達

2.3 精神應激后BDNF與CREB的相關分析

將精神應激后即刻、精神應激后24h各對應腦區BDNF與CREB灰度值作相關分析，精神應激后即刻BDNF蛋白與P－CREB作Pearson相關分析，發現兩者明顯相關（P均＜0.05）；精神應激后24hBDNF蛋白與P－CREB作Pearson相關分析，亦發現兩者明顯相關（P均＜0.05）；說明二者存在明顯時空相關性。見表1。

表1 精神應激后各對應腦區BDNF與CREB的Pearson相關分析（數值均為相關系數）

3 討論

既往有關應激后BDNF表達的研究較多，但本研究不同于之前的研究。首先，本研究是采用旁觀電擊大鼠應激模型研究精神應激鼠BDNF的表達；其次，本研究采用免疫組織化學技術同時探討了大腦多部位、多腦區不同時點的BDNF的表達，即BDNF的時空表達。本研究發現，精神應激后即刻BDNF蛋白表達明顯下調，與對照組比較差異有極顯著性；精神應激后0.5h、1hBDNF表達開始恢復，但仍少于對照組，差異有顯著性；精神應激后2hBDNF表達恢復至對照組水平，兩組比較無明顯差異；精神應激后6hBDNF表達繼續增高，明顯高于對照組，差異有顯著性；精神應激后24h BDNF表達達最高值，明顯高于對照組，差異有極顯著性。以上結果說明，首先精神應激確實對機體造成了損傷，應激后即刻BDNF的表達明顯減少；其次，精神應激后不同時間，BDNF在逐漸恢復，2h時恢復至對照水平，其后仍逐漸增高，至24h時達最大值。精神應激時BDNF的這種快速表達及快速翻譯成蛋白，支持BDNF參與了應激反應的觀點［7］，同時，考慮到BDNF具有對多種神經元有促進生存、分化、再生、增進代謝、增強功能表達、營養、支持、保護及增強突觸可塑性［8］的作用，BDNF在精神應激后的表達增多，說明BDNF在精神應激中發揮了保護作用。這種保護作用的發揮，可能就是通過BDNF表達的上調發揮其修飾樹突生長，增強突觸效能，調節應激環路的組織、功能和反應性等功能實現的［9］。BDNF的表達能在這么短的時間內恢復并增加，一方面說明機體對精神應激有自身保護作用，另一方面說明BDNF參與了機體精神應激狀態下的“異穩態平衡”，個體正是通過這種“異穩態平衡”來盡快擺脫或戰勝應激原以使“內穩態平衡”恢復，使機體不出現外顯的異常狀態。

BDNF發揮保護作用的可能機制又是如何呢？BDNF要發揮保護作用，首先要與其受體trkB結合，結合后誘導受體二聚化，繼而通過酪氨酸殘基自身磷酸化激活該酶的活性區。受體的酪氨酸位點磷酸化后能激活許多下游信號通路，如Ras－MAPK級聯，磷脂酰肌醇激酶（PI－3K）通路及磷脂酶C（phospholipase C，PLC）級聯［10］。可能的通路是Ras－MAPK通路。Ras是第1個被激活的信號轉導蛋白－小GTP結合蛋白Ras，激活的Ras引起C－raf結合到質膜，并在Ser217和Ser221位點磷酸化MEK1（MAPK的激酶），引起ERK1／2（extra cellular signal－related protein kinase）的 磷酸化，ERK1／2激活RSK后，RSK在Ser133磷酸化CREB，使其與CBP（CREB結合蛋白）結合，由此產生擴大的轉錄信號刺激Bcl－2的激活，Bcl－2為一種抗凋亡蛋白。可見該通路是通過刺激抗凋亡蛋白的表達，從而發揮保護作用。該通路可簡單描述為BDNF＋trkB→Ras→MEK1→MAPK→ERK1／2→P－CREB→Bcl－2。由此通路可看出BDNF可以通過多種信號級聯激活CREB，CREB再進而放大信號，從而發揮保護作用。本文發現精神應激后即刻P－CREB明顯減少，應激后24h時較對照又明顯增多，BDNF的時空表達和CREB的時空表達兩者是一致的；并且發現精神應激后即刻和精神應激后24hBDNF和P－CREB及二者mRNA對應腦區的灰度值都存在明顯正相關。本研究結果也驗證了以上提出的通路假設。Conti等［11］通過對CREB基因突變鼠和野生鼠的研究亦發現，BDNF的時空表達和CREB的活動是互相平行的，與本研究結果類似。

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