微生物全自動儀器聯(lián)合快速檢測兒童血液致病菌的分析

唐之儉

（上海市中山醫(yī)院青浦分院，上海 201700）

微生物全自動儀器聯(lián)合快速檢測兒童血液致病菌的分析

唐之儉

（上海市中山醫(yī)院青浦分院，上海 201700）

目的 針對探討兒童血培養(yǎng)的細(xì)菌檢測和鑒定的快速方法。方法 用法國生物梅里埃公司提供的兒童專用血培養(yǎng)瓶 PF，經(jīng) BacT/ Alert3D 儀檢測生長細(xì)菌的陽性標(biāo)本，從中提取菌體后，直接用 WALKAWAY96/PIUS 自動化儀器儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定 ( 直接法 )，同時(shí)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基平板，用分純的菌落進(jìn)行自動化儀器法的細(xì)菌鑒定 (標(biāo)準(zhǔn)法 )，比較兩法的符合率。結(jié)果 直接法共鑒定了 50 份模擬標(biāo)本和 42 份臨床血液標(biāo)本的細(xì)菌，與標(biāo)準(zhǔn)法對照，模擬標(biāo)本 50 份，革蘭陰性桿菌總符合率 88.28%，革蘭陽性球菌符合率為 80.00%，總符合率為88.00%。臨床標(biāo)本 42 份，革蘭陰性桿菌總符合率 90.48%，革蘭陽性球菌符合率為 80.92%，總符合率 80.90%。 結(jié)論 聯(lián)合應(yīng)用 BacT/ Alert3D 儀和 WALKAWAY 自動化儀器儀，可以縮短血液培養(yǎng)的細(xì)菌檢測和鑒定時(shí)間。直接法鑒定革蘭陰性的腸桿菌科細(xì)菌，結(jié)果滿意。

兒童血液培養(yǎng)；細(xì)菌鑒定；全自動分析

隨著自動化、計(jì)算機(jī)在近年的發(fā)展，原先的手工和半自動化血液培養(yǎng)方法發(fā)展成全自動儀器檢測，這一變化的結(jié)果使陽性率得到了提高、檢測時(shí)間得到減少[1-2]。中山青浦分院檢驗(yàn)科微生物室使用了BacT/Alert3D全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測出血液中細(xì)菌生長情況，在此基礎(chǔ)上，用菌體直接進(jìn)行了WALKAWAY自動化儀器法的細(xì)菌鑒定（這些細(xì)菌是從被檢驗(yàn)出是陽性的標(biāo)本中提取出來的），然后，把這這些鑒定結(jié)果和利用分純的細(xì)菌進(jìn)行WALKAWAY自動化儀器法的細(xì)菌鑒定結(jié)果做了比較，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

①標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）：大腸埃希菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC29212）購自衛(wèi)生部上海市臨床檢驗(yàn)中心。②已知菌株：總共是50份，包括46份來自臨床標(biāo)本中分離鑒定后保存的菌株和4份上海市臨床微生物室間質(zhì)評下發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.2 標(biāo)本的來源

①模擬標(biāo)本：它是已知菌株和標(biāo)準(zhǔn)的菌株聯(lián)合制成的；總數(shù)為50株。②臨床標(biāo)本：為我院2011年1月1日至2012年4月1日期間，兒科門診以及病房懷疑菌血癥兒童（年齡在14歲內(nèi)）的血液標(biāo)本，總送檢標(biāo)本為726份，經(jīng)BacT/Alert 3D儀確定為陽性54份。陽性率為：7.57%。選取其中42株進(jìn)行比較鑒定。

1.1.3 儀器

全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)（BacT/Alert 3D 120）法國生物梅里埃；全自動微生物鑒定系統(tǒng)（WALKAWAY96/PLUS自動化儀器）美國西門子診斷。

1.1.4 培養(yǎng)基

血培養(yǎng)瓶為BacT/Alert配套專用的兒童專用瓶（PF），具中和抗生素功能。細(xì)菌鑒定藥敏板為WALKAWAY自動化儀器儀器配套專用的革蘭陰性菌板NC31和革蘭陽性菌PC20。血平板，麥康凱平板和巧克力平板為上?？片敿紊锛夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.5 無菌試管

北京金山川科技發(fā)展有限公司提供 BD醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的一次性無熱源真空塑料管。

1.2 方法

1.2.1 模擬標(biāo)本的制備

經(jīng)過了復(fù)蘇傳代后的已知菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株，把它們制成菌液，濃度0.5McFarland，把梯度稀釋后濃度為101CFU/mL的菌液加入有5mL正常人靜脈血液培養(yǎng)瓶中，最后，把培養(yǎng)瓶放在BacT/Alert系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.2 BacT/Alert3D陽性瓶的檢出與標(biāo)本處理

將已經(jīng)接種的臨床標(biāo)本和模擬標(biāo)本的培養(yǎng)瓶放入BacT/Alert系統(tǒng)后，輸入相關(guān)的資料，系統(tǒng)就會自己完成孵育、檢驗(yàn)和結(jié)果的保存與報(bào)告。系統(tǒng)會在瓶中檢驗(yàn)出細(xì)菌生長時(shí)發(fā)生響聲警報(bào)。抽取一些培養(yǎng)液，涂片行革蘭染色，同時(shí)，將麥康凱平板、巧克力平板和血平板和它接種。再把另外的10mL培養(yǎng)液放在高溫高壓處理后的無菌試管中，經(jīng)過150×g離心5min，上清收集2mL，放在BD無菌試管中，再經(jīng)過5min的150×g離心，取出沉淀，經(jīng)2次無菌鹽水洗滌離心，將菌細(xì)胞收集。

1.2.3 鑒定細(xì)菌的直接WALKAWAY自動化儀器方法(直接法)

將離心制備的菌細(xì)胞，用配套鹽水制成菌懸液（革蘭陰性桿菌為0.5 McFarland，革蘭陽性球菌為1.0 McFarland），接種WALKAWAY自動化儀器儀的NC31和PC20鑒定板。

1.2.4 鑒定細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)法

將陽性瓶的標(biāo)本轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基平板中，18～24h、35℃過夜孵育，提取純菌落。按WALKAWAY自動化的操作說明上機(jī)檢測。

1.2.5 解釋結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)法和直接法鑒定的細(xì)菌名字是一樣的，而且，鑒定率的可信度≥80%，認(rèn)為這兩種方法的結(jié)果是符合的。

2 結(jié) 果

經(jīng)BacT/Alert全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測出的陽性標(biāo)本也經(jīng)過了WALKAWAY全自動微生物鑒定藥敏系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)法和直接法的細(xì)菌鑒定試驗(yàn)。模擬標(biāo)本50份，革蘭陰性桿菌總符合率88.28%，革蘭陽性球菌符合率為80.00%，總符合率為88.00%。臨床標(biāo)本42份，革蘭陰性桿菌總符合率90.48%，革蘭陽性球菌符合率為71.48%，總符合率80.90%。詳見表1。

3 討 論

這個(gè)實(shí)驗(yàn)對臨床標(biāo)本和模擬標(biāo)本用了直接法來鑒定細(xì)菌，和標(biāo)準(zhǔn)法比較，臨床標(biāo)本和模擬標(biāo)本中鑒定革蘭陰性桿菌的符合率為90.48%和88.28%，都比革蘭陽性桿菌的71.48%和80.00%高。革蘭陰性桿菌的腸桿菌科細(xì)菌符合率高，它在臨床標(biāo)本和模擬標(biāo)本的鑒定符合程度都極高。因?yàn)楹芏噫溓蚓头前l(fā)酵菌在鑒定卡中有不少的陰性反應(yīng)，生長并不充分，附加實(shí)驗(yàn)不精確，所以此試驗(yàn)結(jié)果并不理想，這需進(jìn)一步探討。

表1 標(biāo)準(zhǔn)法和直接法鑒定細(xì)菌結(jié)果的符合情況

處理BacT/Alert 3D陽性瓶的標(biāo)本，第一要做的就是進(jìn)行圖片染色看看它是混合菌還是單一菌生長，混合菌要轉(zhuǎn)種到平板分離純菌株，而單一菌可以依據(jù)染色體的形態(tài)、性質(zhì)用直接法在相應(yīng)鑒定卡上鑒定，鑒定過程中，要將單一菌轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)基平板，得到的純菌落再用于復(fù)核結(jié)果和實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充。從BacT/Alert陽性瓶中提取菌細(xì)胞的量與純度對用直接法鑒定細(xì)菌的結(jié)果、可信度、所用時(shí)間都至關(guān)重要，最初離心是為了除去培養(yǎng)液中吸附劑等有形成分，盡量讓它沉淀；抽取的培養(yǎng)液最少10mL，來確保有足夠的菌細(xì)胞。

菌血癥的主要病原菌是腸桿菌科細(xì)菌，占檢出菌的30%～40%[3,4]，結(jié)果表示，用BacT/Alert儀檢測血培養(yǎng)，腸桿菌科細(xì)菌能在24h內(nèi)馬上檢出的占80%，加上直接法鑒定，比轉(zhuǎn)種培養(yǎng)平板少18～24h，用WALKAWAY自動化儀器儀鑒定的時(shí)間更短，8h內(nèi)就可完成94.6%的腸桿菌科細(xì)菌，革蘭陽性球菌在13h內(nèi)的完成比率是64.2%，非發(fā)酵菌是83.8%。

微生物鑒定和藥物敏感性測定對于臨床治療具有重要的意義，準(zhǔn)確快速的藥敏測定已越來越成為臨床治療的迫切需求，微生物自動化儀器的應(yīng)運(yùn)而生就充分體現(xiàn)了這一優(yōu)異的性能。WALKAWAY/ 96PLUS的高級專家系統(tǒng)是一種計(jì)算機(jī)化藥敏綜合分析程序，其功能具有：判斷藥敏表型和鑒定菌種是否一致，在不一致時(shí)提出修改意見或建議重新進(jìn)行鑒定；根據(jù)藥敏結(jié)果分析可能存在的耐藥機(jī)制，并對藥敏結(jié)果進(jìn)行修訂。因此大大提高了鑒定和藥敏結(jié)果作為臨床治療依據(jù)的準(zhǔn)確性。

研究認(rèn)為，聯(lián)合應(yīng)用BacT/Alert3D和WALKAWAY自動化儀器系統(tǒng)，對經(jīng)確定為陽性的血液培養(yǎng)標(biāo)本，通過離心提取菌體直接用WALKAWAY自動化儀器儀鑒定細(xì)菌，能更快完成分析腸桿菌科細(xì)菌引起的菌血癥的病原學(xué)。尤其適用于兒童感染性疾病中血培養(yǎng)的快速檢測，為臨床兒科發(fā)熱，血流感染病患提供及時(shí)，準(zhǔn)確的信息。

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R446.11

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：1671-8194（2013）05-0096-03