川崎病易感性及冠狀動脈損害與PD-1rs41386349多態(tài)性的關(guān)系

姜亞男，張宏艷，林書祥

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070;2天津市兒童醫(yī)院)

川崎病(KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(MCLS)［1］，是一種主要發(fā)生在5歲以下嬰幼兒的急性發(fā)熱出疹性疾病，其病理學(xué)特點為系統(tǒng)性血管炎，主要累及中等大小的肌性動脈，以冠狀動脈損害最為常見。目前，KD已經(jīng)取代風(fēng)濕熱成為最常見的兒童獲得性心臟?。?～4］。流行病學(xué)資料提示，KD具有一定的遺傳易感性［5，6］。程序性凋亡基因-1(PD-1)rs41386349與 KD 的發(fā)生顯著相關(guān)［7］，PD-1可能是KD的遺傳易感基因。本研究旨在探討KD易感性及冠狀動脈損害與PD-1rs41386349多態(tài)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 KD組:2010～2012年于天津市兒童醫(yī)院就診的典型KD患兒25例，男15例、女10例，年齡(2．07±1．80)歲，均為漢族，均符合 KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，丙種球蛋白治療均敏感。參照美國心臟協(xié)會及日本衛(wèi)生部的KD并冠狀動脈損害診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，將患兒分為冠狀動脈損害組(12例)和無冠狀動脈損害組(13例)。對照組:20例漢族健康兒童，男12例、女8例，年齡(9．38±2．59)歲，均無自身免疫性疾病及相關(guān)家族史。研究對象均簽署知情同意書。

1．2 方法

1．2．1 PD-1rs41386349檢測方法 采用 RT-PCR方法。采用DNA提取試劑盒(PROMEGA#A7710，PROMEGA公司)分別抽提各組外周全血細(xì)胞DNA;利用上游引物5'-ACGGCCTGCAGGACTCAC-3'及下游引物 5'-AGGCAGGCACATATGTG-3'，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:96℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min、56 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸1 min(33個循環(huán))，72℃延伸7 min;并設(shè)置陰性對照。擴(kuò)增片段長225 bp。取符合要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司，進(jìn)行純化測序。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上，用比對生物序列一級結(jié)構(gòu)的BLAST算法進(jìn)行序列比較及分析。對于測序結(jié)果不十分明確的樣本，進(jìn)行反向測序，進(jìn)一步驗證后方可納入統(tǒng)計。

1．2．2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件。采用χ2檢驗分析各組基因型數(shù)據(jù)的遺傳平衡;采用χ2檢驗與Fisher確切概率法，比較KD組與非KD組、KD組中合并冠狀動脈損害與未合并冠狀動脈損害者中PD-1rs41386349等位基因頻率與基因型頻率。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 PD-1rs41386349的電泳及基因測序結(jié)果 見圖 1、2。

圖1 PD-1rs41386349的電泳圖

圖2 PD-1rs41386349基因型測序圖

2．2 各組PD-1rs41386349等位基因和基因型頻率比較

2．2．1 KD組和對照組PD-1rs41386349等位基因/基因型頻率比較 KD組PD-1rs41386349等位基因/基因型 C、T、CC、CT、TT 的數(shù)目分別為 21、29、5、11、9，對照組中的數(shù)目分別為 29、11、11、7、2;KD 組中T等位基因頻率明顯高于對照組(P=0．004)，其中CT和TT基因型的OR值均＞1，而CC基因型頻率的OR值＜1，說明T等位基因可能是KD的致病基因，而C等位基因?qū)τ贙D可能是一個保護(hù)性基因。

2．2．2 冠脈損害組和無冠脈損害組KD患兒PD-1rs41386349等位基因/基因型頻率比較 冠脈損害組 KD 患兒等位基因/基因型 C、T、CC、CT、TT 的數(shù)目分別為11、13、2、7、3，無冠脈損害組中的數(shù)目分別為10、16、3、4、6，兩組各基因型與等位基因頻率比較，P 均 ＞0．05。

3 討論

KD是一種自身免疫性全身脈管炎癥性疾病，該病在急性期存在明顯的免疫失調(diào)。而PD-1基因作為一種免疫開關(guān)存在于多種自身免疫性疾病中。最近的研究表明，PD-1基因是在T細(xì)胞活化后被誘導(dǎo)產(chǎn)生的，當(dāng)PD-1基因與其配體1、2結(jié)合后，可以反作用于T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞的繼續(xù)活化并加速免疫細(xì)胞的凋亡，從而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生［10，11］。PD-1基因有缺陷的兒童即使免疫反應(yīng)達(dá)到頂峰，PD-1基因也不能發(fā)揮其免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用，致使T淋巴細(xì)胞被無限制激活，機(jī)體免疫失衡，這正是KD急性期的一個重要特點。

本研究將焦點集中于免疫開關(guān)，免疫開關(guān)是感染后機(jī)體由正常的免疫應(yīng)答向自身性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變過程中導(dǎo)致KD發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。本研究首次對中國漢族兒童PD-1rs42386349等位基因/基因型頻率進(jìn)行調(diào)查，并分析了該位點單核苷酸多態(tài)性與KD的相關(guān)性。結(jié)果表明，KD組與對照組中PD-1rs41386349的等位基因頻率與基因型頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;但是，KD組中合并冠狀動脈損害與未合并冠狀動脈損害的患者之間，PD-1rs41386349的等位基因頻率與基因型頻率比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

研究發(fā)現(xiàn)，10% ～20%的KD患兒出現(xiàn)復(fù)發(fā)或?qū)Υ髣┝康拿庖咔虻鞍讻_擊療法出現(xiàn)耐藥。對于這樣的患病人群，可采用一種新的治療方法，即通過激活PD-1基因使之與其配體1、2結(jié)合從而抑制T細(xì)胞的活化，發(fā)揮免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用，使得機(jī)體處于免疫平衡狀態(tài)，阻止全身性脈管炎的發(fā)生［11，12］。但PD-1信號廣泛存在且關(guān)系復(fù)雜，這種治療模式可能帶來許多不良反應(yīng)，如何處理有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們認(rèn)為PD-1rs41386349與中國兒童KD的發(fā)生存在相關(guān)性，然而，PD-1rs41386349與KD患兒是否合并冠狀動脈損害無明顯相關(guān)性。但是，由于研究對象、人種等因素的不同，可能會影響研究結(jié)果，因此還需要在樣本量足夠、病例選擇多樣化等前提下，進(jìn)行多中心的臨床對照研究。此外，至今已發(fā)現(xiàn)KD與多個遺傳易感基因相關(guān)，PD-1基因多態(tài)性只能與一部分KD發(fā)病相關(guān)。因此，我們還需要對整個KD遺傳易感基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析、總結(jié)，從而找出其關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行研究，以進(jìn)一步明確KD的發(fā)病機(jī)制，為開展KD的個體化預(yù)防、治療提供新的理論依據(jù)。

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