SSc-PF小鼠肺組織和外周血中Th2細胞水平、IL-10表達變化及意義

李 宇，張建全，鐘小寧，雷 玲，謝佳峻

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

系統性硬化病(SSc)是一種病因不明，以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征，可影響內臟包括心、肺和消化道器官的全身性疾病。其49．4%～90.0%的患者會出現肺纖維化(PF)，在各種結締組織中發生率最高，也是病死率增加的一個重要原因［1］。目前，對SSc-PF起始和持續的發病機制仍未完全清楚，尚無有效措施預防或逆轉疾病的進程。Th2細胞是重要的促纖維化細胞，以分泌IL-4、IL-10為特征，可促進成纖維細胞活化、增生，最終導致特發性PF形成［2］。2012年 5～12月，我們觀察了SSc-PF小鼠肺組織及外周血Th2細胞水平和IL-10表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1．1 材料 實驗動物:雌性 BALB/c小鼠30只，SPF級，6周齡，體質量20 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，正常飼養。藥品與試劑:注射用鹽酸博萊霉素(BLM，日本化藥株式會社生產，批號491240，15 mg/支)，羥脯氨酸(HYP)測試盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DNA純化試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)，PCR試劑和引物(日本TaKaRa公司)。

1．2 方法

1．2．1 分組與造模 將小鼠分成3組，A組10只小鼠背部中央區皮下注射PBS作為對照，20只采用BLM皮下局部注射法［3］建立SSc模型，根據PF半定量評分將模型組分為B組(PF≥3分)11只和C組(PF＜3分)9只。

1．2．2 標本采集 小鼠通過眶后動脈放血處死，收集外周血1．0 mL，以4 000 r/min 離心 15 min，吸取上層血清，用于檢測血清IL-10。用肝素抗凝管收集小鼠外周血1．5 mL，PBS重懸，用于分離得到外周血單個核細胞(PBMC)。剪下小鼠背部無毛皮膚并分成2份，一份用于檢測羥脯氨酸(HPY)含量，一份投入10%中性甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋，制成4μm厚切片進行病理觀察。打開小鼠胸腔，取出左肺上葉迅速移至－80℃冰箱保存，用于熒光定量PCR檢測;左肺下葉分2份，一份用10%中性甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋，制成4μm厚的切片進行病理觀察，另一份用于檢測HYP的含量。右肺用于提取單個核細胞(MC)。

1．2．3 皮膚、肺部炎癥及纖維化觀察 皮膚及肺組織切片做Masson和HE染色，用病理圖像分析儀系統軟件測量皮膚厚度［4］。皮膚和肺部炎癥評分:0分沒有，1分少許，2分輕度，3分中度，4分重度。由2位病理科醫生隨機選取左下肺組織切片區域進行單獨閱片，觀察非重復的10個視野，放大200倍，進行Ashcroft半定量PF評分。

1．2．4 HYP測定 采用樣本堿水解法，精確稱取肺組織和皮膚50 mg放入試管中;加入水解液1 mL，混勻，95 ℃水浴 30 min，調整 pH 6．0 ～6．8;加入適量活性炭，充分混勻，離心，取1 mL進行檢測;在波長550 nm處檢測吸光度(A)值，然后換算成HYP含量(μg/mg)。

1．2．5 肺組織及外周血Th2細胞檢測 取出右肺，根據參考文獻［5］提取肺組織中的MC。PBMC采用Ficoll-泛影鈉不連續密度梯度離心法分離得到。采用美國BD公司四色熒光流式細胞儀檢測CD+4IL-4+Th2細胞，Cell Quest流式分析軟件進行分析。

1．2．6 肺組織IL-10 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取小鼠左肺下葉肺組織100 mg，用Trizol法提取總RNA進行逆轉錄反應。膠回收純化DNA片段作為標準品，β-肌動蛋白作為內參照，SYBR綠色Ⅰ核酸凝膠染料進行熒光定量PCR檢測。各引物序列:β-肌動蛋白上游引物為 5'-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3'，下游引物為5'-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3'，擴增產物 200 bp;反應條件:94 ℃ 20 s，57．5 ℃ 30 s，72 ℃ 31 s，40 個循環;IL-10上游引物為5'-CCATGGCCCAGAAATCAAGG-3'，下游引物為5'-TCTTCACCTGCTCCACTGCC-3'，擴增產物129 bp;反應條件:95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。采用標準曲線法計算mRNA相對表達量，將IL-10 mRNA與β-肌動蛋白mRNA相對表達量的比值為其mRNA表達量校正值，經均一化處理后得出其相對量。所有樣本均設置3個復孔。

1．2．7 外周血IL-10檢測 采用ELISA法，操作按試劑盒說明書進行。

1．2．8 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件。正態分布的計量資料用ˉx±s表示，組間比較采用方差、秩和和t檢驗分析;相關性檢驗用Spearman相關分析法。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 皮膚和肺組織病理觀察 A組小鼠背部注射部位皮膚和肺組織結構完整，無明顯的炎癥細胞浸潤和膠原纖維增生;B、C組小鼠皮膚明顯增厚，膠原纖維明顯增生，附屬器萎縮及大量炎癥細胞浸潤;見插頁Ⅰ圖2。B組肺部結構明顯破壞，可見大量淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，并且有肺泡、肺間質及支氣管壁中度以上纖維性增厚或者有纖維束的形成;C組肺部結構無明顯破壞，肺泡、肺間質及支氣管壁無或僅有少量纖維性增厚。各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較，見表1。

表1 各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較±s)

表1 各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 C 組比較，#P ＜0．01

組別 n 皮膚厚度(μm)炎癥評分(分)HYP(μg/mg)皮膚 肺部A 組 10 40．77 ±12．66 0．40 ±0．52 0．40 ±0．52 0．60 ±0．7皮膚 肺部PF評分(分)0 1．45 ±0．40 0．38 ±0．16 B 組 11 97．87 ±22．02* 2．82 ±0．75* 2．36 ±0．81*# 4．00 ±1．41*# 3．07 ±1．26* 0．64 ±0．08*#C 組 9 91．73 ±15．33* 2．44 ±0．73* 1．33 ±0．50* 1．50 ±0．76* 2．43 ±0．61*0．45 ±0．08

2．2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細胞比例和IL-10水平比較 見表2。

表2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細胞比例和 IL-10 水平比較( ±s)

表2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細胞比例和 IL-10 水平比較( ±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與 C 組比較△P ＜0．05，▽ P ＜0．01

組別 Th2細胞(%)肺組織IL-10外周血 肺組織外周血IL-10(pg/mL)mRNA A組9．90 ±7．42 7．40 ±4．93 76．82 ±25．74 8．60 ±6．88 B 組 23．23 ±5．32＊△ 23．50 ±5．40#△ 126．77 ±42．78#▽ 21．36 ±7．88#C 組 12．28 ±7．10 14．72 ±6．81 76．56 ±27．74 16．00 ±6．56*

2．3 各指標的相關關系 PF、肺部炎癥評分與皮膚厚度、炎癥評分呈正相關(r分別為0．687、0．791，P均＜0．05)，外周血、肺部Th2細胞與肺部炎癥、HYP、PF 評分呈正相關(r分別為 0．586、0．535、0．595和0．538、0．423、0．581，P 均 ＜ 0．05)。IL-10 mRNA在肺組織的表達量與肺部炎癥、HYP、PF評分呈正相關(r分別為 0．532、0．460、0．474，P 均 ＜0．05)，血清IL-10水平與肺部炎癥、HYP、PF評分呈正相關(r分別為 0．387、0．461、0．410，P 均 ＜0．05)。肺部Th2細胞與肺部IL-10 mRNA、外周血IL-10 水平呈正相關(r分別為 0．517、0．363，P 均 ＜0．05)，外周血Th2細胞與肺部IL-10 mRNA呈正相關(r=0．444，P ＜0．05)。

3 討論

小鼠背部皮下局部注射BLM，導致小鼠局部皮膚硬化并出現PF，產生自身抗體，且組織纖維化和自身抗體的產生與CD+4T細胞激活有關，這一模型很好地模擬了人類SSc-PF的主要特征［3］。本研究使用BLM在小鼠背部皮膚局部注射，與對照組比較，B、C組小鼠皮膚明顯增厚，HYP、皮膚炎癥明顯增多;且B組小鼠出現肺部結構明顯破壞，肺泡、肺間質和支氣管壁纖維不同程度增厚，肺部炎癥和纖維化評分、HYP較A、C組明顯增多。提示造模后小鼠皮膚和肺部出現炎癥與纖維化病變特征，成功再現了SSc繼發性PF的模型。隨著皮膚厚度和炎癥加重，肺部炎癥和纖維化程度也越來越重。

PF是由多種病因引起的慢性、間歇性和廣泛的肺部疾病，其主要病理特點是彌漫性肺泡炎，肺間質纖維細胞增殖，大量細胞外基質積聚，肺泡結構紊亂和PF［6］。T細胞在PF發病機制中起到重要作用。一些研究表明，Th2細胞及其細胞因子對于PF起主要調節作用。Th2細胞及其細胞因子促進肺、皮膚等多種器官的纖維母細胞滋生和細胞外基質產生，加強膠原蛋白、纖連蛋白及肌腱蛋白的合成等［2］;此外，IL-4還是成纖維母細胞強有力的趨化因子。有實驗表明，抗氧化轉錄因子Nrf2通過調節肺氧化水平和轉移Th1/Th2細胞間的平衡誘導Th1細胞反應，可以防止BLM致PF［7］。本研究發顯示，與A組比較，B組小鼠外周血和肺部CD+4IL-4+Th2細胞數明顯增多，且與肺部炎癥評分、肺部HYP含量呈正相關，提示Th2細胞參與SSc-PF的發病，可能在PF病變中起促進作用。另外，有研究顯示Th2細胞通過促進成纖維細胞活化、增生，使膠原蛋白合成增加，并且能夠抑制其降解，導致基質蛋白沉積和纖維組織生成，最終形成纖維化［7］。

本研究顯示，B、C組小鼠肺部IL-10 mRNA和B組外周血IL-10水平較A組明顯增高，且肺部IL-10 mRNA表達量、血清IL-10水平與肺部炎癥與纖維化評分、肺部 HYP 顯著正相關。Barbarin 等［8，9］在PF小鼠模型中發現過度表達的IL-10可加重肺纖維化，且IL-10通過激活Th2型細胞因子，增加IL-4、IL-13等表達，促進PF形成［10］。動物實驗研究也證實，IL-10可能通過CCL2/CCR2軸促使纖維細胞聚集和巨噬細胞活化最終導致PF［11］。最近研究表明，IL-10 主要通過上調 TGF-β1、IL-4、IL-13 等表達參與PF發病，這些都提示IL-10在SSc-PF中扮演重要角色。在Th0細胞分化過程中，IL-10可抑制Th0細胞向Th1細胞分化，誘導其向Th2細胞分化，且Th2也能產生IL-10。本研究發現，Th2與IL-10呈正相關，推測IL-10的增高可能與Th2增高有關，兩者在SSc-PF發病中可能起促進作用。

總之，Th2細胞和IL-10在SSc-PF小鼠模型外周血、肺組織表達增高，且與肺部炎癥和纖維化呈正相關，兩者可能促進SSc-PF發病，抑制Th2細胞及其相關的細胞因子將有可能成為未來治療SSc-PF的靶點。

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