去甲斑蝥素對肝癌細(xì)胞AIF蛋白的影響

李先茜，余 琛，吳嘉熙，李水軍，李曉麗

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室，上海200031)

斑蝥素是從中藥斑蝥中提取的抗腫瘤活性成分，70年代曾試用于治療原發(fā)性肝癌，能夠緩解患者病情，但其劇毒以及對泌尿系統(tǒng)的嚴(yán)重刺激限制了其臨床應(yīng)用。去甲斑蝥素(NCTD)是斑蝥素的衍生物，由呋喃與馬來酐氫化制成，其構(gòu)型與斑蝥素相似，但1、2位去除了斑蝥素的兩個甲基，因此對泌尿系統(tǒng)的刺激基本消失。NCTD主要用于治療肝癌、食管癌及胃癌等，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和獨(dú)特的升高白細(xì)胞作用。2011年7月～2012年12月，本研究觀察了NCTD對肝癌組織中分子標(biāo)志物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)蛋白的影響，旨在為NCTD治療肝癌的療效及用量提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購自上海細(xì)胞所國家細(xì)胞庫，NCTD購自山東莒南制藥廠，小牛血清、MTT和二甲基亞砜購自上海普飛生物技術(shù)有限公司，RPMI 1640干粉培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自GBICO公司，抗體AIF購自SANTA公司。主要儀器:熒光倒置顯微鏡(日本)，CO2培養(yǎng)箱(英國)，紫外分光光度計(美國HACH公司DR/4000UV-VIS)，電泳裝置(BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ)，轉(zhuǎn)移裝置(BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ)，恒流恒壓電泳儀(BIO-RAD公司 Mini-PROTEANⅡ)，搖床(上海申能博彩生物公司)，膠片分析儀(上海天能公司)。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)與接種 將肝癌細(xì)胞加入含10%小牛血清的RPMI 1640高糖培養(yǎng)基，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);細(xì)胞貼壁后用0．25%胰酶消化，分瓶再培養(yǎng)，待進(jìn)入對數(shù)生長期約為傳代后24 h時，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗，0．25%胰酶消化，用培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至4．25×105/mL，接種到6孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為8．5×105個，共4孔，分別為藥物 NCTD 濃度0、10、50、100 g/mL組。5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。

1．2．2 藥物作用細(xì)胞后總蛋白的提取及濃度測定待細(xì)胞貼于細(xì)胞培養(yǎng)板底后，將6孔板中原細(xì)胞培養(yǎng)上清液倒掉，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液配制的濃度為0、10、50、100 g/mL NCTD，置5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。將藥物作用后的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗，0．25%胰酶消化，離心，棄上清，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液。冰上放置10 min，重懸5 s，離心，收集上清液至新管中，加入工作液并震蕩混勻，用紫外分光光度計測A595值。

1．2．3 Western blot實驗 取對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞加入不同濃度培養(yǎng)液配制的NCTD，調(diào)整至終濃度為0、10、50、100 g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS 洗2 次，加入細(xì)胞裂解液100μL，離心20 min，取上清液，肝癌細(xì)胞總蛋白定量后分別取50 g總蛋白加入上樣緩沖液，95℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉后依次加入一抗和二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌。加入化學(xué)發(fā)光試劑，放入暗盒中顯影，照相，應(yīng)用凝膠成像儀軟件進(jìn)行半定量分析。

1．2．4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用PEMS3．1統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組總蛋白濃度檢測結(jié)果 與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時測出的樣品數(shù)值及總蛋白濃度見表1。

2．2 NCTD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中AIF蛋白的表達(dá) Western blot實驗結(jié)果見圖1。0、10、50、100 g/mL NCTD作用于肝癌細(xì)胞后，從線粒體釋放入胞質(zhì)的AIF蛋白被活化，AIF的表達(dá)量分別為(0．28±1．5)%、(0．37 ±1．6)%、(0．46 ±2．2)%，與對照組的(0．14±1．2)%相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0．05或＜0．01)，且其活化程度呈濃度依賴性。

表1 總蛋白濃度與樣品數(shù)值檢測結(jié)果

圖1 NCTD對肝癌細(xì)胞AIF表達(dá)的影響

3 討論

我國每年至少有11萬人死于原發(fā)性肝癌，占世界肝癌年死亡人數(shù)的45%。雖然近年來肝癌的早期檢出率有所提高，但由于肝癌易發(fā)生早期肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，且85%以上合并嚴(yán)重肝硬化，致使大部分患者確診時已失去手術(shù)機(jī)會［1］。對于不能手術(shù)切除的肝癌患者，中藥治療是重要的治療方法之一。人類應(yīng)用中藥斑蝥治病已有兩千多年的歷史，北宋《仁齋直指方》中已有斑蝥治療癌癥的明確記載。斑蝥為芫青科昆蟲南方一大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥體，其味辛、熱，有大毒，歸肝、胃、腎、大腸和小腸經(jīng)，具有攻毒蝕瘡、逐淤散結(jié)的功效。斑蝥抗癌的主要成分為斑蝥素，NCTD是斑蝥素去甲基化衍生物，抗癌作用進(jìn)一步增強(qiáng)，泌尿系等毒性明顯減輕。NCTD是我國最早人工合成的抗腫瘤藥物，主要用于治療消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌、食管癌、胃癌等，并具有升高白細(xì)胞、保護(hù)肝功能和免疫調(diào)節(jié)等作用。隨著NCTD基礎(chǔ)和臨床研究的深入，其抗癌和升高白細(xì)胞的機(jī)制將進(jìn)一步被闡明，在腫瘤的治療中發(fā)揮更重要的作用。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡失衡有關(guān)，NCTD既可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，也可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［2，3］。AIF是核基因編碼的、相對分子量為57 kD的黃素蛋白，位于線粒體雙層膜間區(qū)。AIF是一種十分保守的蛋白，在人和小鼠中，AIF cDNA的活性具有高達(dá)92%的同源性。其C段第128～612位氨基酸殘基與植物抗壞血酸酶和細(xì)菌的還原型輔酶Ⅰ也有很高的同源性，在凋亡誘導(dǎo)因素的刺激下，AIF可從線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，獨(dú)立地將DNA裂解為60 kB左右的DNA片段，直接引起染色質(zhì)濃縮及DNA的斷裂［4～6］。Bcl家族能通過PT孔的開放調(diào)控AIF的釋放，但不能影響其活性，AIF的凋亡效應(yīng)不依賴 caspase、自身氧化和還原酶的活性［7～9］。另有研究表明，AIF抗體可以抑制 Cyto C的釋放和caspase的級鏈反應(yīng)，但Cyto C和caspase的抑制劑并不能影響AIF的釋放，可見AIF在Cyto C/caspase凋亡途徑的上游發(fā)揮促凋亡作用。

研究顯示，AIF基因敲除或注射抗AIF抗體的細(xì)胞對多種刺激引起的細(xì)胞凋亡有抗性;AIF缺陷小鼠胚胎，缺乏胚胎腔形成過程中應(yīng)有的細(xì)胞凋亡;AIF缺陷胚胎干細(xì)胞對維生素K3和血清饑餓誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生抗性［10］。作為氧化還原酶，AIF對維持線粒體正常的生理功能有重要意義。目前還不能確定這些表型改變是由于滅活A(yù)IF誘導(dǎo)凋亡活性造成，還是AIF的氧化還原酶作用丟失的結(jié)果。AIF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生化機(jī)制尚不十分清楚，AIF可能與其他蛋白共同調(diào)節(jié)完成這一作用。

我們以往的研究表明，NCTD對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長具有很強(qiáng)的抑制作用。本實驗結(jié)果表明，NCTD作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，從線粒體釋放入胞質(zhì)的AIF蛋白被活化，且其活化程度呈濃度依賴性。AIF蛋白可能作為肝癌治療過程中療效的分子標(biāo)志物之一，這為肝癌治療過程中的療效觀察及藥物用量提供有利的實驗依據(jù)。

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