AGT、ApoB、ApoE、MTHFR、eNOS 基因多態性與昆明地區冠心病的關系

馬 娟，陳吉麗

(昆明市第一人民醫院，昆明650000)

冠心病(CHD)是由環境因素和遺傳因素共同作用導致的復雜疾病［1］。近年來，國內外陸續開展了對心腦血管疾病致病基因的研究，但多局限于單個基因的多態性，而且研究結果因不同種族、不同地區人群及不同研究方法而存在差異。目前對冠心病多基因交互作用的研究報道并不多見。本研究利用基因芯片技術，選擇與冠心病密切相關的血管緊張素原(AGT)、載脂蛋白 B(ApoB)、載脂蛋白 E(ApoE)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)等5個基因多態性位點，研究它們與冠心病的相關性及基因—基因的交互作用。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2007年1月～2009年12月我院收治的CHD患者89例(CHD組)，均經冠狀動脈造影確診，至少一支主要血管狹窄≥50%。其中男62例、女27 例，年齡(60．01 ±12．40)歲。同期選擇冠狀動脈造影未發現病變者78例作為對照組，男44例、女 34例，年齡(64．27±11．28)歲。兩組父系、母系3代均居住在云南昆明境內，且個體均無血緣關系。

1．2 方法

1．2．1 臨床資料收集 患者入院后采集清晨空腹肘靜脈血，離心處理后，采用雙試劑酶法檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C。用Hp5500超聲心動儀對左室舒張末徑(LVDd)、左室收縮末徑(LVSd)進行二維測量，計算左室射血分數(EF)，EF=(左室舒張末徑－左室收縮末徑)/左室舒張末徑。

1．2．2 基因多態性檢測 ①基因組DNA提取:采集患者靜脈血0．5 mL，加入2%EDTA溶液，2～8℃保存，采用酚—氯仿法提取基因組DNA。②相關基因多態性檢測:用上海百傲生物技術有限公司提供的基因芯片檢測 AGT M235T(MM、MT、TT)、ApoB XbaI(X－X－、X+X－、X+X+)、ApoE 112/158(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)、MTHFR C667T(CC、CT、TT)及 eNOSD298E(EE、DE、DD)等5 個位點基因多態性，按說明書進行操作。主要儀器:離心機:centrifuge TGL-16G，上海安亭產品。核酸蛋白檢測儀:Biophotmeter，eppendorf產品。PCR擴增儀:My-CyclerTM Thermal Cycler，BIO-RAD公司產品。凝膠成像分析儀:Gel Doc 2000TM，BIO-RAD公司產品。生物芯片識讀器:Biochip Reader，上海百傲生物技術有限公司產品。基因分析軟件:Array Doctor2．0，由上海百傲生物技術有限公司提供。每次檢測均設置陰性、陽性、對照品，當軟件判斷標志列、陰性、陽性對照均合格時，會自動輸出檢測結果。見表1。

表1 AGT、ApoB、ApoE、MTHFR 及 eNOS測試結果

1．2．3 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件，計量資料以±s表示，比較采用成組t檢驗。基因多態性分布頻率的比較采用χ2檢驗。多基因交互作用采用MDR1．10版，用交叉驗證有效一致性系數最大、檢驗樣本的準確度最高的原則，尋找等位點基因交互作用的模型。顯著性檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 兩組臨床資料比較 見表2。

表2 兩組臨床資料比較±s)

表2 兩組臨床資料比較±s)

注:兩組各指標比較，P均＞0．05

組別 n TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL(mmol/L) LVDd(mm) LVSd(mm) EF(%)CHD 組 89 4．81 ±1．27 2．01 ±1．28 1．11 ±0．31 51．73 ±8．40 36．19 ±10．37 56．85 ±14．31對照組 78 4．88 ±1．37 1．91 ±1．13 1．17 ±0．34 50．94 ±9．76 34．46 ±11．26 60．28 ±14．10

2．2 基因型多態性頻率的Hardy-Weinberg平衡檢驗 AGT M235T(MM、MT、TT)、ApoB XbaI(XX－、X+X－、X+X+)、ApoE 112/158(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)、MTHFR C667T(CC、CT、TT)及 eNOS D298E(EE、DE、DD)等位點基因型多態性頻率的符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，說明樣本有代表性。

2．3 兩組 AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E基因型及等位基因分布頻率比較 見表3。

2．4 CHD 患者 AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E等位點基因—基因的交互作用 用MDR分析軟件對5個位點基因—基因交互作用進行分析，共出現了3個模型，四位點AGTM235T-ApoE112/158-ApoBXbaI-eNOSD298E模型的交叉驗證一致性系數最大(10/10)，為最佳模型，但兩組比較差異無統計學意義(P＞0．05);三 位 點 AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI差異有邊緣統計學意義(P=0．05)，兩位點AGT M235T-ApoE 112/158無統計學意義(P＞0．05)。見表4。

表3 兩組AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E基因型及等位基因分布頻率比較［例(%)］

表4 5個位點基因—基因交互作用模型及其性能評價

3 討論

3．1 基因多態性與CHD的相關性 近年研究表明，AGT基因 TT 型是冠心病的獨立危險因素［2，3］，AGT基因TT型和ACE基因DD型聯合進一步增加心肌梗死的危險性［4］;但也有結論提示它們之間無相關性［5，6］。本研究結果顯示，CHD 組 AGT M235T基因型分布、T等位基因頻率與對照組相比有統計學差異，AGT基因TT型顯著高于對照組，提示AGT基因TT型與冠心病的發生呈正相關;AGT T等位基因頻率為 0．747 2，與文獻［2，7，8］報道不盡相同，提示存在種族和地域的差異。

目前國內外大部分研究顯示ε4等位基因有致動脈粥樣硬化的作用，與CHD的發病密切相關。Grane 等［9］發現，攜 帶 ε4基 因 (包 括 ApoEε4/4、ApoEε3/4基因型)的患者有更高的頸動脈內膜厚度，并且冠脈病變的范圍和嚴重程度均大于攜有ε3基因(ApoEε3/3)的患者。本研究結果顯示，CHD組ApoEε3/4基因型及ε4等位基因頻率明顯高于對照組，提示ApoE 112/158基因多態性及ε4等位基因與CHD發生呈正相關。但也有少數研究發現ApoE基因型與CHD并無任何聯系［10］。

Peacock等［11］報道，具有X+等位基因者其LDL水平顯著增高。另有研究表明，具有X+X+基因型者的健康人群較X－X－基因型者的ApoB水平明顯增高。X+等位基因頻率在CHD組明顯高于正常對照組，推測ApoB基因本身的功能性突變發生連鎖不平衡，直接導致動脈粥樣硬化的形成，或者通過影響膽固醇酯在HDL和LDL中的轉換速率，導致HDL水平降低，從而促進動脈粥樣硬化的發生發展。本研究結果顯示，ApoB X+X+基因型及X+等位基因與CHD的發生發展呈正相關，與以上結論一致。

目前MTHFR基因C677T多態性與CHD的關系尚存在很大分歧，Rothenbacher等［12］認為MTHFR基因多態性與血漿Hcy水平和CHD無關。Kang等［13，14］報道了MTHFR 突變，并提出MTHFR 是冠心病的一個危險因素。張雄信等［15］通過文獻檢索收集MTHFR基因C677T多態性與CHD關系的全文文獻，對各研究OR值進行Meta分析，結果表明中國漢族人MTHFR基因C677T多態性與CHD有關聯，T等位基因攜帶者易發生CHD。本研究結果顯示，純合突變MTHFR TT基因與CHD的發病具有相關性，而易感的T等位基因頻率與CHD的發生無明顯相關性。

Hingorani等［16］發現，英國東盎格魯地區的冠心病和對照患者eNOS D298E純合體的比例分別為35．9%和 10．2%;Ichihara 等［17］報道，急性心肌梗死患者中eNOSD298E純合體的比例為2．2%，而對照組卻未發現該型;本研究中CHD組eNOSD298E純合體比例為80．90%，對照組為79．49%，明顯高于以上報道，但無統計學差異。

3．2 多個基因交互作用與CHD的相關性 研究發現，CHD的發生與多個遺傳位點的多態性的聯合作用有關，即存在基因—基因之間的交互作用。本研究用MDR統計學方法對CHD患者AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T 及 eNOS D298E 5個位點基因型多態性進行了交互作用的研究，結果顯示，四位點 AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI-eNOSD298E模型的交叉驗證一致性系數最大，為最佳模型，但兩組比較差異無統計學意義。兩位點AGT M235T-ApoE 112/158無統計學意義;三位點AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI差異有邊緣統計學意義。提示 AGT M235T、ApoE 112/158及ApoB XbaI等3個位點基因多態性之間可能存在基因—基因交互作用。分析其原因在于并不是所有CHD患者均攜帶易感基因，在同一個人群中各個易感基因分布頻率不一致，同一個患者同時攜帶多個易感基因概率則更低，鑒于本研究樣本數較少，因此未能完全證實基因位點之間可能存在基因—基因交互作用。本課題是對諸如冠心病等多基因疾病的基因—基因交互作用模型構建及效應預測的有益嘗試。

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