sRAGE對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

宋娟娟，郭彩霞，曾翔俊，王紅霞，張立克，杜鳳和

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050;2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的方法包括缺血預(yù)處置、缺血后處置和內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)釋放等。可溶性糖基化終末產(chǎn)物受體(sRAGE)作為一種內(nèi)源性物質(zhì) ，可減輕心臟［1］、肺［2］、肝臟［3］的缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制［4］直接或間接與線粒體結(jié)構(gòu)或功能障礙有關(guān)，目前研究較多的是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)和線粒體膜電位。文獻(xiàn)報(bào)道［5］，線粒體可通過(guò)調(diào)節(jié)上述結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的前期實(shí)驗(yàn)［6］已經(jīng)證實(shí)，血漿內(nèi)源性sRAGE含量在心臟缺血再灌注損傷過(guò)程中降低;離體細(xì)胞培養(yǎng)［7］顯示，外源性sRAGE可直接作用于缺氧/復(fù)氧(H/R)心肌細(xì)胞，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮心臟保護(hù)作用。外源性sRAGE是否還通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑來(lái)發(fā)揮心臟保護(hù)作用目前少見(jiàn)報(bào)道，2011年1～12月，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 SPF級(jí)健康SD大鼠，鼠齡0～48 h，雌雄不分，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基(GIbco公司，美國(guó))，20%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，JC-1、酯化鈣黃綠素、氯化鈷(CoCl2，Sigma公司，美國(guó))，絲裂霉素 C(Roche公司，美國(guó))，Cleaved caspase-3一抗(cell signal techology公司，美國(guó))，二抗(Santa Cruz公司，美國(guó));蛋白定量BCA試劑盒(北京普利萊技術(shù)公司);倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國(guó))。

1．2 方法

1．2．1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠開(kāi)胸，取心臟2/3剪碎，消化酶反復(fù)消化，收集上清液，離心，重懸細(xì)胞，于5%CO2、37℃條件下差速貼壁30 min，收集細(xì)胞懸液加入絲裂霉素C 2 g/mL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中。24 h后第1次換液，72 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 細(xì)胞分組及H/R模型復(fù)制 ①對(duì)照組:細(xì)胞于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h;②對(duì)照 +sRAGE組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入sRAGE(終濃度900 ng/mL)，余處理同對(duì)照組;③H/R組:細(xì)胞放入低氧培養(yǎng)箱中(2%O2、5%CO2、93%N2)3 h 后，再置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h;④H/R+sRAGE組:細(xì)胞培養(yǎng)液中加入sRAGE(終濃度900 ng/mL)，余處理同H/R組。

1．2．3 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位 取出各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加入JC-1溶液(終濃度10μg/mL)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min后，加入1 mL完全培養(yǎng)基，即刻熒光倒置顯微鏡下觀察、照相。圖像結(jié)果用Image-J軟件分析，以綠色熒光強(qiáng)度平均值與紅色熒光強(qiáng)度平均值的比值代表心肌細(xì)胞線粒體膜電位去極化程度。

1．2．4 Calcein-AM和CoCl2共孵育檢測(cè)mPTP 取出各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加入Calcein-AM溶液(終濃度2μmol/L)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min后加入CoCl2(終濃度4 mmol/L)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，立即避光激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。鏡下隨機(jī)選擇感興趣圖像區(qū)域(ROIs)，用Photo-Shop軟件分析mPTP開(kāi)放情況。

1．2．5 Western-blot法檢測(cè) Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá) 取出各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加入1 mL細(xì)胞裂解液，收集所有心肌細(xì)胞冰上裂解30 min，低溫離心，收集上清，BCA法蛋白定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用凝膠成像分析儀測(cè)定Cleaved caspase-3蛋白光密度，其與 β-actin的比值作為 Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)含量來(lái)反映細(xì)胞凋亡。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，差異顯著時(shí)用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 線粒體膜電位變化 與對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞膜電位去極化程度明顯增加(P＜0．01);而H/R+sRAGE組心肌細(xì)胞去極化程度減輕，與H/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組線粒體膜電位

2．2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放情況 與對(duì)照組比較，H/R組發(fā)生明顯的mPTP開(kāi)放，線粒體大量漏出使熒光強(qiáng)度明顯減弱(P＜0．01)，而H/R-sRAGE組線粒體漏出減少，熒光強(qiáng)度較H/R組增強(qiáng)(P＜0．01)。見(jiàn)圖2。

2．3 Cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，Cleaved caspase-3表達(dá)量顯著增高，心肌細(xì)胞凋亡顯著增加(P均 ＜0．01);而 H/R-sRAGE組 Cleaved caspase-3表達(dá)量減少，與H/R組比較細(xì)胞凋亡減少(P 均 ＜0．05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖2 各組mPTP熒光強(qiáng)度

圖3 各組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷會(huì)調(diào)動(dòng)心臟自身保護(hù)機(jī)制，內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)sRAGE的釋放成為拮抗心肌缺血再灌注損傷的重要靶點(diǎn)。缺血再灌注損傷的眾多機(jī)制都與線粒體結(jié)構(gòu)或功能障礙密切相關(guān)［4］。缺血再灌注損傷會(huì)產(chǎn)生大量自由基，使mPTP開(kāi)放，進(jìn)而使線粒體膜電位去極化，由于二者呈正反饋效應(yīng)，因此膜電位的變化可間接反映mPTP的開(kāi)放情況。mPTP開(kāi)放后，位于線粒體膜間隙內(nèi)的蛋白質(zhì)及其他重要的凋亡因子被釋放出來(lái)，引發(fā)細(xì)胞凋亡［8］;同時(shí)線粒體內(nèi)膜使氧化磷酸化解耦聯(lián)，能量代謝發(fā)生障礙。因此mPTP開(kāi)放是導(dǎo)致缺血再灌注損傷從可逆轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴年P(guān)鍵因素，是多種缺血再灌注損傷機(jī)制的匯合點(diǎn)。研究已證實(shí)，缺血預(yù)處理和后處理均是通過(guò)抑制mPTP開(kāi)放來(lái)實(shí)現(xiàn)H/R心肌保護(hù)作用［9］。

mPTP是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，在生理?xiàng)l件下基本處于關(guān)閉狀態(tài)。某些應(yīng)激條件下(如Ca2+增加、活性氧、線粒體跨膜電位下降、能量衰竭等)可引發(fā)其開(kāi)放。研究發(fā)現(xiàn)，mPTP開(kāi)放發(fā)生在再次供氧后，再灌注15 min內(nèi)進(jìn)行藥物干預(yù)有保護(hù)作用［10］。Gateau-Roesch 等［11］也證實(shí)，在心臟再灌注起始給予藥物或基因治療可以使心肌梗死面積減少30%～50%。我們前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sRAGE拮抗心肌細(xì)胞H/R損傷的最佳濃度為900 ng/mL。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在再灌注起始就給予900 ng/mL sRAGE處理，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞mPTP明顯開(kāi)放，線粒體膜電位明顯下降;而H/R+sRAGE組較H/R組mPTP開(kāi)放明顯較少，線粒體膜去極化程度明顯減輕。提示外源性sRAGE可發(fā)揮心臟保護(hù)作用，其拮抗H/R損傷的作用是通過(guò)抑制mPTP開(kāi)放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

研究證實(shí)，mPTP開(kāi)放會(huì)啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，包括依賴caspases活性和非依賴caspases活性兩種途徑。再灌注后，mPTP開(kāi)放使線粒體膜內(nèi)外電勢(shì)差減少，膜電位下降，進(jìn)而激活caspases家族引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序［5］。caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子和最重要的凋亡執(zhí)行者，其活化形式為Cleaved caspase-3，故Cleaved caspase-3可作為反映細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與H/R組比較，H/R+sRAGE組Cleaved caspase-3表達(dá)明顯減少，說(shuō)明 sEAGE可通過(guò)抑制 Cleaved caspase-3表達(dá)來(lái)減少心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)也間接支持上述sRAGE通過(guò)減少mPTP開(kāi)放拮抗心肌H/R損傷的結(jié)論。

綜上所述，外源性sRAGE可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑來(lái)發(fā)揮心臟保護(hù)作用，其拮抗H/R損傷的作用可能通過(guò)減少 mPTP開(kāi)放、抑制 Cleaved caspase-3表達(dá)、減少心肌細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。但sRAGE發(fā)揮心臟保護(hù)作用是否還通過(guò)線粒體非caspase-3途徑，以及與線粒體介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有無(wú)關(guān)聯(lián)尚不明確，值得進(jìn)一步探討。

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