間斷性缺氧對小鼠海馬tau蛋白異常過度磷酸化的影響

劉 靜，楊 遙，徐江濤

(1石河子大學醫學院，新疆石河子832000;2蘭州軍區烏魯木齊總醫院)

睡眠呼吸暫停綜合征(SAS)患者常伴有認知功能損害，且與癡呆共病率較高［1］。SAS的病理生理改變主要是慢性間斷性低氧—復氧過程。研究發現，持續低灌注和缺血再灌注都會使大鼠腦中tau蛋白過度磷酸化［2，3］，而間斷性缺氧(IH)對 tau 蛋白磷酸化的影響仍不清楚。2011年7月～2012年9月，我們觀察了小鼠IH后不同時間點海馬磷酸化tau蛋白(P-tau)水平，探討IH對tau蛋白磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 SPF級健康雄性成年昆明小鼠30只，體質量19～23 g。隨機分為6組各5只，分別為IH后1、6、12、24、48 h 組及對照組。多克隆兔抗鼠 P-tau抗體Ser199(1∶200，特異性識別Ser199位點P-tau)、tau蛋白抗體［1∶100，檢測總 tau蛋白(T-tau)］購自北京博奧森生物工程有限公司。

1．2 方法

1．2．1 模型制備 IH組按文獻［4］方法處理，IH實驗箱密閉時，小鼠呼吸箱內有限的氧氣造成低氧，然后開啟實驗箱，空氣迅速進入箱內形成復氧，如此關閉120 s、開啟 30 s，循環 8 h(10:00 ～18:00)。IH處理期間箱內最高氧濃度20%，最低10%。對照組置于IH實驗箱內保持空氣自由流動，持續8 h(10:00～18:00)，氧濃度保持在20%左右。

1．2．2 標本采集與處理 大鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，0～4℃生理鹽水洗凈，10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，制成石蠟切片，行HE和P-tau、T-tau免疫組化染色，按說明書操作，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1．2．3 海馬區P-tau、T-tau表達檢測 每組取3張切片，400倍顯微鏡下于海馬區隨機選取5個視野，以胞質呈棕黃色染色為陽性，采用Image-Pro Plus 6．0圖像分析系統對各組陽性細胞進行平均光密度OD值檢測。

1．2．4 統計學方法 采用SPSS17．0統計軟件，計量資料用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 組織病理學改變 HE染色見對照組海馬區細胞形態及分布正常。IH后可見細胞間隙增寬，細胞數目減少，隨著時間延長，部分細胞出現形態學改變，胞核固縮、濃染(見圖1)。

圖1 IH組與對照組的神經元形態比較(×400)

2．2 P-tau、T-tau免疫組化染色結果 P-tau陽性神經元呈棕黃色，主要在胞質和軸突處著色，胞核周圍也染成棕黃色(見圖2)。IH 后6、12、24、48 h組的P-tau表達均高于對照組和IH 1 h組;IH 24 h組表達最明顯。IH后P-tau平均OD值在間斷性缺氧后6 h開始增加，24 h達高峰，到48 h仍高于對照組水平(見表1)。T-tau陽性神經元的胞質和突起呈棕黃色(見圖3)。各組間T-tau的平均OD值差異無統計學意義(見表1)。

3 討論

圖2 IH 6、24、48 h組與對照組的海馬P-tau表達比較(×400)

表1 各組海馬區P-tau、T-tau表達的平均OD值±s)

表1 各組海馬區P-tau、T-tau表達的平均OD值±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與 IH 24 h 組比較，△P ＜0．05，△△P ＜0．01

組別 n P-tau T-tau對照組 5 0．104 ±0．008△△0．155 ±0．014 0．161 ±0．008 IH 1 h組 5 0．110 ±0．012△△ 0．159 ±0．013 IH 6 h組 5 0．125 ±0．015＊△△ 0．153 ±0．016 IH 12 h組 5 0．137 ±0．013＊＊△ 0．158 ±0．015 IH 24 h組 5 0．159 ±0．021＊＊ 0．162 ±0．016 IH 48 h 組 5 0．128 ±0．020＊△△

圖3 HI組與對照組的海馬T-tau表達比較(×400)

SAS患者常伴有認知功能障礙，而一些阿爾茨海默病(AD)患者也合并有SAS，因此推測SAS與AD可能存在某種聯系。一項對38例AD患者的臨床觀察表明，患者SAS的患病率極高，經多導睡眠圖監測證實的SAS者達89．5%，其中睡眠呼吸暫停—低通氣指數＞20的嚴重病例占50．0%，這些患者的血氧飽和度下降較嚴重［5］。Cooke等［1］對 66例輕中度AD患者研究發現，AD患者一般合并SAS，通過治療SAS可以改善其白天執行能力，進而改善認知功能，推斷SAS與認知功能有關。Hrubos-Strom等［6］對29 258例成人進行問卷調查，發現平均血氧飽和度可評價SAS的嚴重程度，且與受訪者的認知功能具有很強的相關性，提示SAS的認知功能損害與其反復發作的低氧血癥相關。SAS患者夜間睡眠呼吸暫停、低通氣期間，血與組織氧飽和度下降，腦血流動力學異常及其生化代謝紊亂，導致腦組織缺氧損傷［7］，神經系統特別是海馬區域對缺氧敏感，長時間缺氧損害易導致認知障礙。以上均提示SAS患者的認知功能障礙與夜間的IH密切相關。

與tau蛋白自身異常和功能障礙相關的一系列散發性或遺傳性的神經退行性疾病稱為tau病［8］，如AD、Pick病、皮層基底節變性、進行性核上性麻痹等。tau蛋白異常磷酸化修飾在AD及其他tau病的發病機制中起重要作用。P-tau蛋白喪失了催化微管裝配和穩定微管結構的正常生物活性，不僅與正常微管相關蛋白互相競爭，影響微管形成，而且促使正常微管相關蛋白與微管分離，使微管崩解，軸突變性，影響神經遞質的合成、運輸、釋放和攝取，造成神經細胞間的物質運輸障礙，從而導致神經退行性變［9，10］。持續低灌注和缺血再灌注都會使大鼠腦中tau蛋白過度磷酸化。Du等［2］發現，大鼠持續低灌注引發海馬tau蛋白過度磷酸化，并使其在神經元中的聚集逐漸增多，造成認知功能障礙進行性加重。本研究對小鼠進行IH處理，根據小鼠晝伏夜出的習性，實驗在日間10:00～18:00進行。結果顯示，IH后8 h小鼠海馬tau蛋白過度磷酸化。說明缺血缺氧是tau蛋白磷酸化的影響因素之一;而IH各時間組及對照組的T-tau比較無統計學差異，提示IH可能不會影響細胞內的T-tau，IH引起tau蛋白磷酸化水平絕對升高，與T-tau無關。

tau蛋白磷酸化狀態取決于其蛋白激酶和蛋白磷酸酶的相對活性。GSK-3β是最強有力的tau蛋白激酶，可以使tau蛋白Ser199在內的多個位點磷酸化，tau蛋白磷酸化水平會隨著GSK-3β的過度表達而增加［11］。有學者推測，腦缺血再灌注引起的tau蛋白過度磷酸化可能與GSK-3β有關［3］。至于IH后tau蛋白磷酸化水平增高是否與GSK-3β相關，則需進一步實驗證實。

［1］Cooke JR，Liu L，Natarajan L．The effect of sleep-disordered breathing on stages of sleep in patients with Alzheimer's disease［J］．Behav Sleep Med，2006，4(4):219-227．

［2］Du AT，Jahng GH，Hayasaka S，et al．Hypoperfusion in frontotemporal dementia and Alzheimer disease by arterial spin labeling MRI［J］．Neurology，2006，67(7):1215-1220．

［3］Wang H，Zhao H，Ye Y，et al．Focal cerebral ischemia induces Alzheimer's disease-like pathological change in rats［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(1):29-36．

［4］劉海林，張子彥，郭云云，等．慢性間斷性缺氧伴二氧化碳潴留小鼠模型的建立［J］．中國比較醫學雜志，2012，22(1):65-68．

［5］ Gehrman PR，Martin JL，Shochat T，et al．Sleep-disordered breathing and agitation in institutionalized adults with Alzheimer disease［J］．Am J Geriatr Psychiatry，2003，11(4):426-433．

［6］Hrubos-Strom H，Nordhus IH，Einvik G，et al．Obstructive sleep apnea，verbal memory，and executive function in a communitybased high-risk population identified by the Berlin Questionnaire Akershus Sleep Apnea Project［J］．Sleep Breath，2012，16(1):223-231．

［7］Schulz R，Seeger W，Fegbeutel C，et al．Changes in extracranial arteries in obstructive sleep apnoea［J］．Eur Respir J，2005，25(1):69-74．

［8］ Wang XF，Dong CF，Zhang J，et al．Human tau protein forms complex with PrP and some GSS-and fCJD-related PrP mutants possess stronger binding activities with tau in vitro［J］．Mol Cell Biochem，2008，310(1-2):49-55．

［9］Amniai L，Barbier P，Sillen A，et al．Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules［J］．FASEB J，2009，23(4):1146-1152．

［10］ Avila J．Tau kinases and phosphatases［J］．J Cell Mol Med，2008，12(1):258-259．

［11］Cuchillo-Ibanez I，Seereeram A，Byers HL，et al．Phosphorylation of tau regulates its axonal transport by controlling its binding to kinesin［J］．FASEB J，2008，22(9):3186-3195．