乳腺癌患者外周血miR-155水平與遠處轉移的相關性

李永憲，紀術峰

(1鄭州市第九人民醫院，鄭州450053;2南方醫科大學珠江醫院)

乳腺癌是我國女性發病率最高的惡性腫瘤，每年因乳腺癌死亡的婦女達1．3萬例［1］。長期以來，人們對乳腺癌腫瘤標志物的研究非常重視。微小RNA(miR)是一類內源性非編碼RNA，長度為20～22 bp，廣泛存在于真核生物細胞中，具有調控細胞分化、發育、增殖的作用，對腫瘤的發生、發展起重要作用。以往細胞的自分泌、旁分泌多指某些信號蛋白分子的分泌;近期研究顯示，細胞還可分泌小分子核酸，即循環 miR［2，3］。本研究比較了 miR-155 在轉移乳腺癌與非轉移乳腺癌患者血清中的表達，并分析乳腺組織中其靶標原鈣黏蛋白9(PCDH92)的表達，以探討miR-155對乳腺癌轉移的預測價值。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇珠江醫院、鄭州市第九人民醫院2009年1月～2012年5月收治的乳腺癌患者40例，均為女性，年齡27～72歲、中位年齡52．3歲。均經病理檢查確診。其中伴遠處轉移(包括肺、肝、骨等)20例(轉移組)，僅有原發病灶20例(非轉移組)。

1．2 方法

1．2．1 實時熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測 收集手術或穿刺獲得的乳腺癌組織液氮凍存，分離血常規檢測后剩余標本的血漿－80℃保存。按mirVanaTMPARISTM試劑盒(美國Applied Biosystem公司產品)說明書的方法抽提血漿和乳腺癌組織的總RNA。取 1μL RNA在NanoDropND-1000 Spectro photometer儀(美國NanoDrop公司)上測定RNA濃度。抽提獲得的RNA置于－80℃保存備用，或直接檢測。使用miR-155的QRT-PCR檢測試劑盒(上海吉瑪公司)檢測血漿miR-155的水平，以U6為內參對照。PCDH9引物:上游引物:5'-TTTAGGAGAAACTACCTTGTGC-3'，下 游 引 物:5'-TGAGCATTAAAGTCACTTGAGG-3'，使用 QRT-PCR試劑盒(Takara公司)檢測乳腺癌組織中PCDH9 mRNA水平，以GAPDH為內參對照。cDNA反轉錄反應條件:37℃ 1 h，95℃ 5 min。PCR反應條件:95℃預熱15 min;94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 34 s，共40 個循環。實驗重復3次。miR-155及PCDH9的表達水平均以正常人乳腺上皮細胞MCF-10A為對照，數據采用 2－ΔΔCT法進行分析。

1．2．2 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件，結果以ˉx±s表示，組間比較采用Oneway方差分析。P≤0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1 兩組血漿miR-155水平比較 QRT-PCR檢測結果顯示，轉移組血漿miR-155水平遠高于非轉移組(P ＜0．01)。見圖1。

2．2 兩組miR-155靶標預測 Targetscan軟件預測miR-155可以與PCDH9基因3'-UTR上8mer種子序列“AGCAUUAA”(459～466 bp)的堿基互補結合。

2．3 兩組乳腺癌組織中PCDH9基因表達比較QRT-PCR檢測結果顯示，轉移組乳腺癌組織中PCDH9 mRNA水平遠低于非轉移組(P＜0．05)。見圖2。

圖1 兩組血漿miR-155水平

圖2 兩組乳腺癌組織中PCDH9 mRNA表達

3 討論

miR僅占人類基因總數的1%左右，卻調控著30%以上的編碼基因表達。由于存在高度組織特異性和實效特異性，miR對多種疾病的診斷、分類、分期及預后判定具有重要意義。2008年，Mitchell等從正常人血漿中分離出18～24個堿基的RNA片段，使用5'和3'RNA-RNA接頭連接，接著應用RTPCR擴增，形成小RNA的cDNA庫，其中93%對應已知的miR。后期的諸多研究也顯示，miR的信號傳遞方式是雙通道或多通道的，即當細胞受到刺激后，能夠選擇性地把miR包裹進細胞內的微小顆粒內，并分泌到循環血液中。特定的生理與病理生理條件下，細胞可一次性分泌多種miR，從而調節靶細胞中多個基因的表達翻譯。成熟miR可長期穩定存在于循環體液中，RNA酶的降解、煮沸、反復凍融、酸堿環境等都不會造成循環miR的損失，影響其長期保存，故動態監測miR是理想的腫瘤診斷、治療和預后判斷的新標志物。

miR具有高度的組織時效性，BIC基因上具有一段138個核苷酸的保守序列，即編碼miR-155的發夾結構，在Burkitt淋巴瘤等腫瘤中顯著高表達。Cai等［4］研究顯示，miR-155在結腸癌細胞中高表達，并通過靶向抑制腫瘤抑制因子CHD5在體內外抑制瘤細胞的增殖。Wang等［5］研究表明，miR-155在人肝癌細胞中的表達較正常細胞高。miR-155高表達也是口腔癌預后差的標志之一［6］。但miR-155在黑色素瘤細胞株［7］及病理瘤組織內低表達，過表達miR-155則可顯著抑制瘤細胞集落形成，并可通過調節POU3F2、MITF基因表達抑制黑色素瘤細胞的侵襲遷移能力［8］。本研究檢測了伴有轉移和僅有原發病灶乳腺癌患者的血漿miR-155水平，結果顯示，轉移患者血漿miR-155水平明顯升高。進一步通過Targetscan軟件預測，發現miR-155可與其靶標PCDH9的3'-UTR上1個8mer的保守位點結合。原鈣黏蛋白是鈣黏蛋白超家族中最大的一個亞家族，該家族成員均具有胞外結構、質膜區及胞內區三部分。Wang等［9］研究顯示，PCDH9在正常腦組織中呈強陽性表達，但在原發性腦膠質細胞瘤樣本表達下調，陽性率約為51．7%，且組織學分級越高，表達下調越顯著，進一步分析PCDH表達與患者5年生存的相關性，結果顯示PCDH9陰性者的預后明顯差于陽性者。本研究應用QRT-PCR法檢測了乳腺癌腫瘤組織中PCDH9的表達，結果顯示，有轉移的乳腺腫瘤組織內PCDH9 mRNA水平遠低于僅有原發病灶的腫瘤組織，也提示PCDH9低表達患者預后較差。

綜上所述，循環miR-155可作為乳腺癌轉移預測的分子標志物，該方法具有創傷小、方法簡便、便捷的優勢，在乳腺癌早期診斷、治療、預后判斷方面有著廣闊的應用前景。

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