Th17細胞在實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠發病中的表達及依達拉奉的保護作用研究①

董 梅 張美月 陳 欣 劉 露 劉瑞春 郭 力

(河北醫科大學第二醫院神經內科 神經病學河北省重點實驗室，石家莊 050000)

多發性硬化(Multiple sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主的自身免疫性疾病，發病機制尚不明確。實驗性自身反應性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS公認的動物模型。Th1細胞曾被認為是造成自身免疫性疾病組織破壞的唯一T細胞亞群，然而Th17細胞亞群的發現使人們對自身免疫性疾病的發病機制有了新的認識［1］。

依達拉奉(Edaravone)是一種氧自由基清除劑，能透過血腦屏障，通過消除脂質過氧化和羥基，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷，阻止腦水腫和腦梗塞的進展，改善缺血神經的損傷，在臨床上主要用于治療急性缺血性腦血管病。Fischer等［2］利用基因芯片證實MS活動性病灶中存在線粒體的損傷，與炎癥相關的氧化損傷在MS脫髓鞘中起重要作用;有研究表明Edaravone能顯著減輕EAE的臨床癥狀，減少脊髓中淋巴細胞的浸潤［3］，提示抗氧化劑 Edaravone在炎癥性脫髓鞘疾病中可能具有治療價值。

我們建立EAE模型，選取Th17細胞及相關細胞因子作為研究對象，探討其在EAE發病中的動態變化及意義，并探討Edaravone對EAE的治療作用及其機制，為MS新的臨床藥物治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料與模型建立

1．1．1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠(合格證編號:1006151)175只，購于河北醫科大學實驗動物中心，6～8周齡，體重180～220克;清潔級豚鼠28只(雌雄不限)，體重350～450克。以標準飼料和飲用水喂養，室溫20～25℃。

1．1．2 主要試劑 兔抗大鼠RORgamma多克隆抗體購于美國Abcam公司;依達拉奉注射液購自南京先聲東元制藥有限公司，10 mg/5 m l;大鼠 IL－6、IL－17酶聯免疫試劑盒購于美國RD公司;反義核酸第一鏈cDNA合成試劑盒，SYBR qPCR綠色體系均購于加拿大Fermentas公司;Trizol組織RNA提取液，DEPC原液均購于美國Invitrogen生命技術公司;引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1．1．3 模型建立及分組 以豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)，為抗原進行免疫，建立Wistar大鼠EAE動物模型。隨機分為Edaravone組和EAE組，自免疫當日起，EAE組給予大鼠腹腔注射生理鹽水1 ml/d，Edaravone組按10 mg/(kg·d)給藥直至處死，各組分別于免疫后第10天(發病前期)，發病后3天(急性期)，發病后7天(緩解期)取材。

1．1．4 神經功能評分 采用通用的評分標準對大鼠進行神經功能評分:0分:不發病;1分:動物尾部無力;2分:后肢輕度癱瘓+步態不穩;3分:中度癱瘓但自主運動保存;4分:肢體嚴重癱瘓，自主運動不能;5分:瀕死狀態。

1．2 標本采集與測定

1．2．1 標本采集與處理 按實驗設計取材，以10%水合氯醛麻醉動物，心臟取血后，取上清液用于ELISA檢測;取大鼠脊髓腰膨大部位，部分以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋進行免疫組化染色，部分組織迅速凍存于液氮中進行RT－PCR檢測。

1．2．2 脊髓RORγt染色 脊髓組織石蠟切片后，按免疫組化常規步驟進行RORγt染色。一抗為兔抗大鼠RORγt，以1∶50稀釋，二抗為羊抗兔 IgG，三抗為辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。以0．01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。胞漿棕褐色為陽性染色。

1．2．3 ELISA 檢測 IL－17、IL－6 水平 檢測均參照試劑盒說明書進行，通過標準品吸光度值(A值)繪制標準曲線，然后計算各樣本的值。

1．2．4 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)檢測 IL－17和HO－1 mRNA表達 采用Trizol試劑提取脊髓腰膨大組織總RNA，逆轉錄為互補cDNA，以此為模板行熒光定量PCR擴增。目的基因引物序列IL－17的上游引物:5'TCCATGTGCCTGATGCTGTTGC 3'，下游引物:5'AGTTATTGGCCTCGGCGTTTGG 3'，產物長度106 bp，退火溫度56℃。HO－1上游引物:5'CTCGCATGAACACTCTGGAGATG 3'，下游引物:5'TCTGTGAGGGACTCTGGTCTTTGT 3'，產物長度147 bp，退火溫度56℃;GAPDH作為內參上游引物:5'CGTTGACATCCGTAAAGACCTTA 3'，下 游 引 物:5AAC－AGTCCGCCTAGAAGCACAAT 3'，產 物 長 度127 bp，退火溫度58℃。實時定量PCR儀分析比較IL－17、HO－1與 GAPDF的相對吸光度值并進行半定量分析。

1．3 統計學分析 應用SPSS13．0統計軟件進行分析，計量資料多組比較應用One－way ANOVA方差分析，組間比較采用SNK法，多個獨立樣本非參數比較采用秩和檢驗，P＜0．05差異有統計學意義。

2 結果

2．1 臨床表現及神經功能評分 動物免疫后逐漸出現精神萎靡、食欲減退、體重下降、皮毛不光滑，于免疫后第12天開始出現尾部無力、后肢癱瘓、大小便失禁等表現，Edaravone組平均發病時間較EAE組明顯推遲(P＜0．01);Edaravone組發病率較EAE組下降(P＜0．05);對急性期臨床神經功能評分，Edaravone組低于 EAE 組(P ＜0．05，見表1)。

2．2 脊髓RORγt表達 在脊髓組織可見炎癥細胞RORγt呈陽性表達，并與炎癥程度呈正相關，Edaravone組各時期RORγt陽性細胞減少，平均秩次均低于 EAE 組(P ＜0．05，見圖1)。

2．3 外周血IL－17、IL－6檢測 EAE組炎癥因子IL－17外周血含量在發病急性期達高峰，隨疾病緩解降低(P＜0．05)，Edaravone組發病前期、急性期和緩解期 IL－17含量均低于 EAE組相應時間點(P＜0．05)。前炎細胞因子IL－6則在發病前期含量最高，之后逐漸降低，Edaravone組IL－6均較EAE組各時間點含量下降，且在發病前期兩組比較差異有顯著意義(P ＜0．05，見表2、3)

表1 各組大鼠臨床發病情況比較Tab．1 Comparison of clinical situations in each group

圖1 不同時期大鼠脊髓RORγt表達(IHC，×400)Fig．1 Positive expression of RORγt in spinal cord in different group(IHC，×400)

表2 各組IL-17含量比較(x±s)Tab．2 The concentration of IL-17 in different groups(x±s)

表3 各組IL-6含量比較(x±s)Tab．3 The concentration of IL-6 in different groups(x±s)

2．4 脊髓組織中 IL－17mRNA和 HO－1mRNA表達EAE組炎癥因子IL－17mRNA表達在急性期最高，隨疾病好轉逐漸降低(P＜0．05)。Edaravone組各組IL－17mRNA表達低于 EAE 組(P＜0．05)。EAE組HO－1mRNA含量隨疾病進展而增高(P＜0．05)，Edaravone組各時期 HO－1mRNA含量均高于 EAE組(P ＜0．05，見表4、5)。

3 討論

既往認為MS及其動物模型EAE都由Th1細胞介導。近年發現敲除Th1效應因子IFN－γ的EAE小鼠比野生型EAE小鼠病情更嚴重。用IFN－γ抗體干預EAE，反而使其病情加重，說明在EAE發病過程中，除了傳統認為的Th1細胞參與致病外，可能還存在另外一類能誘導自身免疫的細胞亞群。

表4 各組IL-17 m RNA表達比較(x±s)Tab．4 The expression of IL-17 mRNA in different groups(x±s)

表5 各組HO-1 m RNA表達比較(x±s)Tab．5 The expression of HO-1 mRNA in different groups(x±s)

最近發現一個新的細胞亞群，因分泌IL－17被命名為Th17細胞，由初始CD4+T細胞在TGF－β和IL－6的共同誘導下分化為Th17，RORγt是控制Th17細胞分化的關鍵的轉錄因子［4］。Th17細胞的發現源于對EAE和膠原誘導性關節炎(CIA)的研究，Th17細胞被證實能通過分泌炎癥介質IL－17誘導嚴重的自身免疫反應，缺失Th17細胞能防止或減輕EAE和CIA等自身免疫病的發病［5］。IL－17是一種重要的炎癥介質，通過刺激其他細胞產生IL－6等促炎癥介質，介導并放大炎癥反應。它可以募集單核細胞、中性粒細胞等髓樣細胞到炎癥部位，促進局部炎癥環境的產生，許多研究表明IL－17在炎癥反應中起到了重要的作用［6］。Kürtüncü 等［7］發現作為國際上公認的治療MS藥物β干擾素(IFN－β)，其對MS早期的治療效果是通過調節Th17的免疫功能實現的。

IL－6在Th17細胞分化中起著十分關鍵的作用，在TGF－β單獨的作用下，活化的初始CD4+T細胞分化為具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg細胞，而在TGF－β和IL－6的共同誘導下分化為 Th17細胞，抑制了Treg細胞表達，從而介導機體的前炎癥反應［8］。Korn 等［9］研究發現 IL－6 缺陷(IL－6－/－)的基因敲除鼠，不能分化成Th17細胞，同時其未致敏T細胞主要分化為Treg細胞，Th17的分化受到抑制，表明IL－6在促進炎癥反應中有重要的作用。

RORγt特定表達于T細胞區域，在外周血中指導炎性Th17細胞的分化并調節 IL－17的產量［10］。Ivanov等［11］研究認為 TGF－β 和 IL－6 共同作用下先誘導未致敏的CD4+Th細胞表達RORγt，然后啟動Th17細胞的分化并誘導基因IL－17的轉錄表達。

我們的實驗表明外周血中IL－6在發病前期濃度最高，達到高峰，之后逐漸下降，早于IL－17達高峰;IL－17在發病前期濃度有所增高，在急性期達高峰，疾病緩解后降低，說明IL－6作為前炎性細胞因子在疾病早期即迅速表達，可誘導Th17細胞分化，促進IL－17的產生，在發病前期發揮促炎作用;而IL－17作為主要的炎癥效應因子，與疾病發生發展程度一致，在疾病高峰期含量最高，導致組織損傷。有研究表明在EAE中Th17分泌的IL－17破壞血腦屏障，引起單核細胞和嗜中性粒細胞趨化，效應性T細胞沿著小靜脈向腦或者脊髓白質浸潤，導致中樞神經系統炎癥［12］。脊髓中RORγt陽性表達的炎癥細胞數目隨疾病加重而增多，急性期數量最多，疾病好轉后逐漸下降，仍高于發病前期，與IL－17的變化是一致的，支持RORγt調控Th17細胞的分化及IL－17的生成。

HO－1是血紅素代謝途徑的限速酶，能催化血紅素轉變為膽綠素、CO和游離鐵，可被氧化應激所誘導。以HO－1上調為表現的氧化應激是脫髓鞘疾病中炎癥反應的突出特征。HO－1及其催化產物主要保護細胞免受與炎癥和神經變性疾病相關的氧化應激損傷［13］。Chora等［14］研究表明 HO－1 及其催化產物CO能夠減輕EAE發病，通過抑制Th細胞和CD8 T細胞的聚集、增殖控制炎癥反應，緩解疾病發生。Chen等［15］研究表明應用紅細胞生成素EPO可以明顯減輕EAE發病程度，這種保護作用是通過誘導HO－1表達上調、調控免疫應答，即抑制Th1細胞、Th17細胞，升高Treg細胞實現的。我們的研究顯示EAE大鼠發病后HO－1mRNA含量增加，明顯高于發病前期，并隨時間延長表達持續增加，提示HO－1mRNA在炎癥發生后表達迅速增高，從而啟動抗炎及抗氧化的雙重保護作用。

我們以Th17細胞為主軸，探討抗氧化劑Edaravone對MS治療作用及可能機制，研究表明應用Edaravone治療EAE后，前炎細胞因子IL－6、轉錄因子RORγt及炎癥效應因子IL－17的表達均有不同程度下降，而HO－1表達升高，提示Edaravone能夠起到抑制炎癥的作用。有研究表明HO－1可以表達在活化的Th17細胞上，通過抑制IL－6阻止Th17細胞的分化和活性［16］，提示Edaravone可能通過作用于HO－1同時發揮抗氧化應激和抗炎的作用，從而降低動物發病率，減輕臨床癥狀，推遲發病時間。本實驗為開發治療MS的新藥物提供了重要的實驗依據和研究方向。

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