人IL-12/慢病毒重組體對結腸癌干細胞“干性”的影響①

尹曉玲 王正中 趙銀晶 陳華俊 楊曉瓊 梁后杰 (重鋼總醫院腫瘤科，重慶 400081)

結腸癌是常見惡性腫瘤之一，發病率呈逐漸上升趨勢，目前雖有手術、化療、生物治療等常規手段，但結腸癌總生存率并未提高。許多研究表明，腫瘤細胞群中有小部分特殊細胞即癌癥干細胞(Cancer stem cell，CSCs)的存在，且CSCs與腫瘤發生、侵襲、轉移和對傳統治療是否敏感密切相關［1，2］。越來越多的證據支持結腸 CSCs的存在［3，4］，并且可能是腫瘤轉移及復發的主要原因。

眾所周知，大多數傳統治療方法不能靶向CSCs。我們前期研究發現，小鼠IL-12重組質粒轉染小鼠Lewis肺癌細胞后進行瘤內注射可產生明顯的抗瘤免疫作用［5，6］，相關研究支持細胞因子對CSCs同樣具有作用，因此我們推測IL-12對CSCs可能同樣有作用［7］。我們前期試驗證實 CD133+CD44+結腸CSCs如SW480細胞上清液不能測到IL-12，說明CD133+CD44+結腸CSCs不表達或低表達IL-12。IL-12是主要由抗原遞呈細胞(APC)如單核細胞產生的細胞因子［8］，人IL-12對腎癌、皮膚T細胞淋巴瘤、黑色素瘤及卵巢癌腹膜轉移的患者均有不同程度的臨床效應［9-14］，瘤內注射 Ad．IL-12(腺病毒IL-12)可行并且安全［15］。

基于這些結果，我們推測構建 IL-12過表達CSCs模型將有效抑制CSCs生存及腫瘤生長。本研究利用高效轉染的慢病毒作為載體構建IL-12過表達質粒，將其轉染結腸 CSCs，RT-PCR及 Western blot觀察其在結腸CSCs表達及對其“干性”的(自我更新及分化)影響，為進一步進行動物實驗打下基礎。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 細胞培養液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重組表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF-2)均購于Gibco公司。含綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體表達質粒(pGCFU)購于Genechem公司;pORF-hIL-12 G2質粒購于InvivoGen公司;CCK-8試劑盒購于江蘇碧云天公司;胰酶、DEPC、Tris堿、EDTA均購于 Sigma公司;抗人CD133/PE抗體及抗人CD44/APC抗體購于BD Pharmingen公司;BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific;限制性內切酶(HindⅢ及EcoRⅠ)購于NEB公司產品;DL-2000 DNA分子量標準品購于TaKaRa生物公司;總RNA提取試劑盒購于上海生工;質粒抽提試劑盒購于Promega公司，Taq聚合酶購于Genotech公司。

1．2 細胞培養 結腸癌細胞株SW480由本教研室傳代保存，干細胞條件培養基(不含胎牛血清的DMEM/F12培養基，含20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF-2、1×B27和1% 青鏈霉素)篩選培養2周后，流式細胞儀分選出CD133+CD44+SW480細胞。

1．3 結腸癌CSC的篩選及鑒定 結腸癌細胞條件培養及流式細胞儀分選結腸癌干細胞:結腸癌SW480細胞(購于ATCC)接種于低吸附96孔板(200個細胞/孔)，在干細胞條件培養基中培養2周，篩選出未分化腫瘤細胞，慢慢增殖，形成細胞團塊，即“腫瘤球”。繼續培養1～2周，反復吹打使原始球解聚，移至培養板中再培養增殖。細胞分四組:①分別加入10μl PE(Phycoerythrim，藻紅蛋白)標記的小鼠抗人CD133單克隆抗體及APC(Allophycocyanin，別藻青蛋白)標記的小鼠抗人CD44單克隆抗體;②加入10μl PE標記的小鼠抗人CD133單克隆抗體;③加入10μl APC標記的小鼠抗人CD44單克隆抗體;④加10μl PBS作為空白對照。充分混合，4℃暗處孵育20分鐘。洗滌，離心，重懸細胞上機分選。

富集CD133+CD44+細胞作為結腸CSCs，分選出的CSCs用干細胞培養基培養于37℃、5%CO2孵箱中。

1．3．1 CD133+CD44+SW480細胞增殖實驗 將分選得到的CD133+CD44+SW480及CD133－CD44－SW480細胞制成單細胞懸液，調細胞濃度至5×104m l－1，分別接種于6 塊96 孔板中，0．1 ml/每孔，3 復孔，另設空白對照孔調零，5%CO2、37℃培養。分別在0、1、2、3、4和 5天隨機選取1個96孔板，每孔加入10μl的CCK-8試劑，置于培養箱繼續培養4小時。酶標儀測定450 nm波長處各吸光度值(A450)，取各時間點細胞吸光度的平均值，以時間(d)為橫坐標，A450為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1．3．2 CD133+CD44+SW480 細胞克隆形成能力調整 CD133+CD44+SW480細胞和 CD133－CD44－SW480細胞濃度至1×104ml－1。接種于6孔板中，5%CO2，37℃培養2～3周。當6孔板中出現肉眼可見的克隆時終止培養。棄去培養液，用PBS液浸洗3次。加入5 ml甲醇固定15分鐘，姬姆薩染液染色10分鐘，倒置顯微鏡觀察并計數克隆數。

1．3．3 CD133+CD44+SW480 及 CD133－CD44－SW480細胞無血清培養成球能力 調整CD133+CD44+SW480細胞和CD133－CD44－SW480細胞濃度。各取10 000個兩組細胞分別加入6孔板中，5%CO2，37℃培養。隔日換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長，7天后終止培養。

1．3．4 NOD/SCID體內成瘤能力 雌性 NOD/SCID鼠15只(n=5)，5～6周齡，體重25～30 g，飼養在無特定病原體(Specific pathogen-free，SPF)級的潔凈層流架內。分別將CD133+CD44+SW480細胞和CD133－CD44－SW480細胞制成單細胞懸液。常規消毒皮膚，按 100/只、1 000/只、10 000/只接種到裸鼠雙側前肢背部皮下。接種后每周兩次觀察小鼠，6周后處死小鼠，統計不同亞群細胞的成瘤情況。

1．4 構建IL-12慢病毒表達載體 構建重組IL-12p70慢病毒質粒:根據Genbank中人IL-12 cDNA序列(IL12A GeneID:3592，IL12B GeneID:3593)設計PCR引物，引物含同源重組序列、HindⅢ及EcoRⅠ酶切位點。上游引物為:5'TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA 3'，下游引物為:5'ACCG-GAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG 3'。用 E．coli Fast-Media?Amp培養基(液)擴增含 pORF-hIL-12 G2質粒的E．coli菌，抽提質粒 DNA，以 pORF-h IL-12 G2質粒為模板通過PCR擴增IL-12p70。

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收后通過雙酶切，將IL-12p70 DNA片段與pGC-FU載體連接，將IL-12p70基因片段交換插入pGC-FU，獲得重組質粒 pGC-FU-IL-12。同時以pGC-FU-GFP-LV病毒為陰性對照。

菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送華大基因測序，測序正確的克隆搖菌擴大培養，用除內毒素DNA抽提試劑盒提取質粒DNA，用于病毒包裝，并進行IL-12慢病毒過表達載體的滴度檢測。

1．5 重組腫瘤干細胞模型的建立以及鑒定 IL-12過表達慢病毒質粒轉染結腸CSCs:轉染前一天，取生長狀態良好的CD133+CD44+SW480細胞，調整細胞濃度，用不含抗生素的干細胞培養基接種細胞到24孔板，5×104細胞/孔。分組:①未轉染細胞組;②IL-12過表達慢病毒載體轉染細胞組;③空載體轉染細胞組。在EP管里分別加入50μl Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium 和0．8μg IL-12過表達慢病毒載體DNA，輕柔混勻，制成DNA稀釋液。在另一個EP管里分別加入50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 和 2．0 μl TransLipid，制成TransLipid稀釋液，室溫靜置5分鐘。將兩種稀釋液輕柔混合，室溫靜置20分鐘，形成DNA-TransLipid復合物。將該復合物加入到接種好的細胞中，37℃，5%CO2培養6小時后更換培養基繼續培養18小時。在轉染24小時后將細胞按照1∶10的比例接種到新鮮培養基中，第二天加入選擇性培養基進行篩選。穩定轉染細胞稱作慢病毒-IL-12。轉染72小時后，收集培養上清液，離心去除細胞碎片，然后將上清用0．45μm的PVDF濾膜過濾，RT-PCR和 Western blot檢測培養上清液IL-12表達。

1．5．1 RT-PCR檢測細胞上清液IL-12基因表達按說明書抽提細胞培養上清總RNA，室溫干燥5～10分鐘至RNA呈半透明狀，加入30μl DEPC處理過的水溶解，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。抽取的RNA經逆轉錄后用于PCR擴增。RTPCR擴增產物用1%瓊脂糖電泳分析。

1．5．2 Western blot檢測細胞上清液IL-12蛋白表達 用蛋白抽提試劑盒-Ⅱ提取，濃縮上清至原體積的1/30～1/10，即為細胞上清液總蛋白。蛋白樣品按照1∶4的比例加入5×上樣緩沖溶液，100℃變性5分鐘，BCA法測蛋白濃度，SDS-PAGE垂直電泳，電轉膜，抗原-抗體反應，化學發光法顯色，通過在BIO-RAD凝膠成像分析系統上進行掃描及圖像分析。用相對灰度值表示蛋白相對含量。

1．6 IL-12 對結腸 CSCs“干性”的影響

1．6．1 IL-12對結腸CSCs克隆形成能力的影響將轉染 IL-12過表達慢病毒質粒及未轉染的CD133+/CD44+SW480細胞計數后，調整細胞濃度。各取10 000個兩組細胞分別加入6孔板中，加入適量條件培養基，5%CO2，37℃培養。每隔1天半量換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長情況，7天后終止培養。

1．6．2 IL-12對結腸CSCs分化的影響 為了觀察IL-12對結腸CSCs的體外分化能力的影響，我們取轉染IL-12過表達慢病毒質粒的細胞及未轉染的CD133+CD44+SW480在條件培養基中形成的克隆細胞球，移入含10%胎牛血清培養基中連續觀察其生長情況，1周后用SP免疫組化試劑盒檢測兩組細胞CK20表達(結果判斷:被測細胞胞漿染色黃-棕色為陽性表達)，同時流式細胞儀檢測兩組細胞中CD133+CD44+SW480比例。

2 結果

2．1 流式細胞儀分選出CD133+CD44+SW480細胞 經條件培養的SW480細胞含有(90．8±4．5)%CD133+CD44+細胞(圖1A)，并能形成典型的“神經球”結構，而 PBS空白對照組只有(1．2±0．3)%CD133+CD44+細胞(圖 1B)，皮下接種 100個CD133+CD44+SW480細胞和CD133－CD44－SW480細胞均不能成瘤;接種1 000個/只CD133+CD44+小鼠中有2只成瘤，接種 10 000個/只 CD133+CD44+小鼠均能在2周內成瘤，而1 000個/只及10 000個/只CD133－CD44－在6周內均不能成瘤。因此我們推測SW480細胞株中存在干細胞。

CD133+CD44+SW480細胞于條件培養基中培養，細胞呈懸浮生長，單細胞、圓形、透亮。培養3天后，細胞成球形懸浮生長(圖2A)。到第7天時形成較大的腫瘤細胞球，形態大小各異，而且較前致密(圖2B)。將懸浮細胞球移入含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養基中，常規培養4小時后，細胞變為梭形，少部分開始貼壁生長;24小時后完全貼壁生長(圖2C)。CD133－/CD44－SW480培養2周均不能形成細胞球(圖2D)。與 CD133－CD44－SW480相比，CD133+CD44+SW480有更強的增殖能力，至第5天，細胞增殖明顯，曲線變陡直，而CD133－CD44－SW480曲線較平坦。對各時間點A450進行比較，結果表明兩組細胞間差異具有統計學意義(圖2E)。克隆形成實驗顯示:培養3周后，CD133+CD44+SW480形成的細胞克隆數為271．22 ±57，而 CD133－/CD44－SW480 為 22．24 ±6．56。提示CD133+CD44+SW480具有更強的克隆形成能力，差異具有統計學意義(P＜0．05，圖2F)。

圖1 流式細胞儀分選CD133+CD44+SW 480結腸癌干細胞Fig．1 CD133+/CD44+SW 480 colon CSCs was sorted by flow cytometry

圖2 CD133－CD44－SW 480及CD133+CD44+SW 480在不同培養基中增殖克隆Fig．2 CD133－CD44－ SW 480 and CD133+CD44+SW 480 proliferated in differentmedium

2．2 慢病毒-IL-12表達質粒構建成功并抑制CD133+CD44+SW480自我更新 IL-12基因及慢病毒載體通過雙酶切及連接，成功構建慢病毒-IL-12表達質粒。轉化感受態大腸桿菌后挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定，膠回收得到長約1 700 bp的目的基因片段。重組質粒測序結果顯示，重組質粒中的目的片段與Genebank中的序列符合，證實IL-12基因已成功克隆到慢病毒載體。以上結果證實慢病毒-IL-12表達質粒構建成功。

將293T細胞包裝病毒24小時后，熒光顯微鏡下可見細胞內大小不等的綠色熒光顆粒，細胞生長狀態良好(圖3B)，收獲病毒并濃縮，對包裝病毒滴度進行檢測，IL-12慢病毒平均滴度3．5×108ml－1，結果表明成功的進行了慢病毒-IL-12的包裝，可以進行下一步實驗。

RT-PCR和 Western blot檢測表明，將慢病毒-IL-12或空載體(空白對照)轉染CD133+CD44+SW480，慢病毒-IL-12上清液表達 IL-12 mRNA(圖3C)和蛋白(圖3D)，但空白對照無表達，而結腸細胞WM35上清也表達IL-12 mRNA和蛋白，但表達水平明顯低于慢病毒-IL-12。將CSCs懸浮于無血清的CSCs培養液中，腫瘤球形成后光學顯微鏡觀察腫瘤球數量。值得注意的是，轉染IL-12/慢病毒重組體的CSCs不能形成明顯的腫瘤球(說明增殖率降低)(圖3E)。而未轉染IL-12/慢病毒重組體的CSCs形成表型和結構上和初代基本相同的克隆球(圖3F)。結果顯示IL-12降低了結腸CSCs自我更新能力。

2．3 IL-2對結腸CSCs分化的影響 為了觀察IL-12對結腸CSCs體外分化能力的影響，轉染后1周，我們分別將轉染及未轉染IL-12-慢性毒重組體的CSCs移入含10%小牛血清培養基中連續觀察其生長情況，我們發現:克隆細胞球于接種后24小時貼壁生長，隨后的幾天有分化的貼壁細胞從細胞球中游出，并逐漸形成成片貼壁細胞。我們對分化細胞進行免疫組化染色，結果顯示，與對照組相比(圖4B)，IL-12增加CSCs分化標志CK20表達(圖4A)，同時降低 CSCs CD133+CD44+SW480比例(圖4C)，說明其可能促進CSCs分化。

圖3 慢病毒-IL-12轉染細胞后，IL-12表達及對細胞自我更新的影響Fig．3 IL-12 expression and it’s effects on cell self-renewal after lentivirus/IL-12 transfected in cell

圖4 IL-12促進結腸CSCs分化Fig．4 IL-12 promote colon CSCs differentiation

3 討論

最近研究表明，CSCs能夠始發免疫缺陷小鼠腫瘤生長［1，2］，并與腫瘤轉移及復發相關。從理論上講，靶向CSCs治療能夠徹底消除腫瘤復發及轉移，因此靶向CSCs的腫瘤治療策略將比目前的傳統治療方法能更有效地根治腫瘤，減少復發和轉移的發生率，為腫瘤的靶向診治提供了新靶標，為根治腫瘤帶來了新希望。關于CSCs特異性的表面標志物目前尚無定論，根據目前國內外相關文獻報道，采用雙抗體標記CSCs也許是一種更好的選擇，因此本研究我們聯合CD133和CD44兩種抗體富集CSCs，并且發現經條件培養的SW480結腸癌細胞經流式細胞分選后CD133CD44陽性表達率為(90.8±4.5)%，通過無血清成球、增殖、克隆形成和小鼠體內致瘤能力對其“自我更新能力”進行了初步鑒定，證實結腸癌SW480存在CSCs。

免疫抑制仍是多數預期較好的腫瘤治療手段的主要障礙，而細胞因子失衡是機體免疫功能紊亂的主要原因，并導致腫瘤進展及復發。關于細胞因子的抗瘤免疫反應相關研究包括 IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等，已有研究表明，IL-12能有效地增多腫瘤的抗瘤免疫反應，但IL-12對CSCs是否同樣有作用并不清楚。

慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)病毒，包裝后能產生攜帶目的基因的重組慢病毒(是一類缺陷病毒)，離開包裝細胞后病毒顆粒僅能轉導細胞，但不能自我復制，此為其安全性提供了更為有效的保證。慢病毒載體既能感染分裂活躍期的細胞，又能高效率感染分裂緩慢或非分裂期的細胞;能夠攜帶較大及多個外源性基因，轉染后對轉錄沉默作用有較強的抵抗力，能長期穩定表達目的基因;另外還具有感染效率高、免疫反應低等特點。根據慢病毒載體的特性，本研究選用慢病毒作為攜帶目的基因的載體。

本研究中，我們成功構建含IL-12 cDNA的重組慢病毒質粒，用包裝病毒的工具細胞293T細胞包裝純化后，獲得較高滴度的病毒顆粒，將其轉染CD133+/CD44+SW480細胞，慢病毒-IL-12細胞高表達IL-12 mRNA及蛋白，說明穩定轉染IL-12的結腸CSCs系建立，同時也證明慢病毒作為基因研究的載體具有低毒、高效的優勢。體外實驗證實，IL-12促進分化標志CK20表達，降低CD133+CD44+SW480細胞比例，說明IL-12可促進結腸CSCs分化;另一方面，IL-12抑制結腸CSCs成球，說明IL-12可抑制結腸CSCs增殖。本研究為進一步研究IL-12對結腸CSCs惡性表型的影響奠定基礎，為細胞因子進行CSCs治療提供實驗依據。

1 Al-HajjM，Wicha M S，Benito-Hernandez A etal．Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2003;100:3983-3988．

2 Singh S K，Hawkins C，Clarke ID et al．Identification of human brain tumour initiating cells［J］．Nature，2004;432:396-401．

3 O’Brien C A，Pollett A，Gallinger S et al．A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficientmice［J］．Nature，2007;445:106-110．

4 Ricci-Vitiani L，Lombardi D G，Pilozzi E et al．Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells［J］．Nature，2007;445:111-115．

5 尹曉玲，趙銀晶，楊 彪et al．IL-12瘤苗與131I-1E2協同抗瘤作用研究［J］．中國腫瘤臨床，2010;37(16):930-932．

6 尹曉玲，何建軍，孫世良et al．IL-12瘤苗聯合放療對小鼠Lewis肺癌作用研究［J］．中國腫瘤臨床，2007;34(2):100-103．

7 Todaro M，Alea M P，Di Stefano A B et al．Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resistcell death by production of interleukin-4［J］．Cell Stem Cell，2007;1:389-402．

8 TrinchieriG．Interleukin-12:a cytokine produced by antigen-presenting cells with immunoregulatory functions in the generation of T helper-type1(Th1)cells and cytotoxic lymphocytes［J］．Blood，1994;84:4008-4027．

9 Cebon J，Jager E，Shackleton M J et al．Two phase I studies of low dose recombinant human IL-12 with melan-A and influenza peptides in subjects with advanced malignantmelanoma［J］．Cancer Immun，2003;3:7-10．

10 Duvic M，Sherman M L，Wood G S et al．A phase II open-label study of recombinanthuman interleukin-12 in patients with stage IA，IB，or IIA mycosis fungoides［J］．JAm Acad Dermatol，2006;55:807-811．

11 Gollob JA，Mier JW，Veenstra K etal．Phase I trial of twice-weekly intravenous interleukin 12 in patients with metastatic renal cell cancer or malignant melanoma:ability to maintain IFN-gamma induction is associated with clinical response［J］．Clin Cancer Res，2000;6:1678-1682．

12 Gollob JA，Veenstra K G，Parker R A et al．Phase I trial of concurrent twice-weekly recombinant human interleukin-12 plus lowdose IL-2 in patients with melanoma or renal cell carcinoma［J］．J Clin Oncol，2003;21:2564-2568．

13 Motzer R J，Rakhit A，Schwartz LH etal．Phase I trial of subcutaneous recombinant human interleukin-12 in patients with advanced renal cell carcinoma［J］．Clin Cancer Res，1998;4:1183-1187．

14 Motzer R J，Rakhit A，Thompson JA etal．Randomizedmulticenter phase II trial of subcutaneous recombinant human interleukin-12 vs．interferon-alpha 2a for patients with advanced renal cell carcinoma［J］．J Interferon Cytokine Res，2001;21:257-261．

15 Sangro B，MazzoliniG，Ruiz J etal．Phase Itrialof intratumoral injection of an adenovirus encoding interleukin-12 for advanced digestive tumors［J］．JClin Oncol，2004;22:1385-1389．