糖基化終產(chǎn)物對雪旺細(xì)胞體外功能的影響及其機(jī)制的研究

張 媚，張臨洪

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其機(jī)制尚不明確［1-2］。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)髓鞘細(xì)胞，可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元存活、促進(jìn)軸突生長的作用，其在糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)得到廣泛關(guān)注［3］。糖基化終產(chǎn)物 (advanced glycation end products，AGEs)是長期的高血糖狀態(tài)經(jīng)非酶糖化和脂質(zhì)氧化等一系列反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重排所形成的非酶類物質(zhì)［4］，與AGEs特異性受體 (receptor of advanced glycation end product，RAGE)結(jié)合后，激活并誘發(fā)一系列促炎、促凝血反應(yīng)，參與到糖尿病的神經(jīng)、視網(wǎng)膜、血管、腎臟等多種并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中［5］。在人類糖尿病患者和實(shí)驗(yàn)糖尿病動物的外周神經(jīng)中都檢測到了AGEs的存在［6］。然而AGEs對于雪旺細(xì)胞的功能究竟有何影響，AGEs是否通過影響雪旺細(xì)胞的功能參與糖尿病周圍神經(jīng)病變，目前并不清楚。本研究初步探討AGEs對于原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞的增殖遷移等功能的影響及機(jī)制，以期為糖尿病周圍神經(jīng)病變提供新的潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 預(yù)備新生3 d的雄性SD乳鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 2%膠原酶、0.25%胰酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清 (FBS)購于GIBCO公司;凋亡檢測試劑盒購于BD公司;核因子κB(NF-κB)活性檢測試劑盒購于PIERCE公司;腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測盒、白介素6(IL-6)檢測試劑盒購于Peprotech公司;熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購于Takara公司;兔抗鼠Caspase-3抗體和羊抗兔二抗購于Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 原代分離純化雪旺細(xì)胞 乳鼠脫頸椎處死，75%乙醇消毒，暴露坐骨神經(jīng)，剝離其外膜，將神經(jīng)纖維剪成1 mm的小段，置于2%膠原酶和0.25%胰酶等量混合液中消化20 min，然后棄去消化酶，反復(fù)吹打洗滌，用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板中，每3 d換1次液，觀察細(xì)胞生長情況。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行雪旺細(xì)胞標(biāo)志蛋白S100染色鑒定。

1.2.2 制備AGEs 牛血清清蛋白 (BSA)終濃度5.0 g/L，葡萄糖終濃度50 mmol/L，充分溶于磷酸鹽緩沖液 (PBS)中，過濾除菌，37℃避光孵育3個月，除去未結(jié)合的葡萄糖;同法制備不含葡萄糖的BSA作為陰性對照，熒光分光光度計(jì)鑒定AGEs。

1.2.3 細(xì)胞分組與干預(yù) 根據(jù)不同條件處理原代雪旺細(xì)胞，分為7組:分別給予不含任何刺激物的低糖DMEM培養(yǎng)基(空白對照組)、20 μg/ml BSA、20 μg/ml AGEs、50 μg/ml BSA、50 μg/ml AGEs、100 μg/ml BSA 和 100 μg/ml AGEs 干預(yù)細(xì)胞生長，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組細(xì)胞用AGEs處理時(shí)，培養(yǎng)基中FBS水平低至5%。

為了檢測促炎細(xì)胞因子在不同條件下的表達(dá)情況，原代分離的雪旺細(xì)胞分別予以不含任何刺激物的低糖DMEM培養(yǎng)基(空白對照)、50 μg/ml BSA、50 μg/ml AGEs 和 50 μg/ml AGEs+10 μg/ml抗RAGE抗體干預(yù)，共分為4組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 噻唑藍(lán) (MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力 消化、收集雪旺細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。按照上述分組予以干預(yù)因素，將各組細(xì)胞接種到96孔板，每孔200 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl的MTT液體，4 h后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，充分振蕩10 min，置酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測各組OD值。OD值越大，表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.5 Millcell小室檢測細(xì)胞遷移能力 在Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室中進(jìn)行，消化、收集及干預(yù)因素等同細(xì)胞增殖能力檢測，每組3個復(fù)孔，24板孔內(nèi)小室下為含血清濃度為5%的DMEM培養(yǎng)基，上室分別加入200 μl細(xì)胞濃度為105/ml的細(xì)胞懸液。孵育24 h后用4%多聚甲醛固定，拭去膜上層的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)。每孔隨機(jī)取6個視野計(jì)數(shù)，計(jì)算均數(shù)。

1.2.6 雪旺細(xì)胞凋亡的檢測 消化、收集、設(shè)復(fù)孔及干預(yù)因素等同細(xì)胞增殖能力檢測，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，吸取500 μl細(xì)胞懸液，1 000×g離心5 min，棄去上清液，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液 (1×)重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min;1 000×g離心5 min，棄去上清液，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μl碘化丙啶 (PI)染色液，混勻后冰育避光放置;立即行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。細(xì)胞凋亡率=Annexin V-FITC陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7 凋亡基因Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Caspase-3的mRNA水平:用Trizol法提取各處理組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞RNA，用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。引物根據(jù) GenBan cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，Caspase-3:上游為5'-CAGACAGTGGAACTGACGAT-3'，下游為5'-TTTCAGCATGGCGCAAAGTG-3';內(nèi)參照GAPDH:上游為 5'-CAACGGCACAGTCAAGGCTGAGA-3'，下游為5'-CTCAGCACCAGCATCACCCCAT-3'，反應(yīng)體系 10 μl。擴(kuò)增條件:首先95°C預(yù)變性30 s，然后95°C變性5 s，55°C退火，72°C延伸，循環(huán)40次，延伸階段系統(tǒng)收集熒光信號，計(jì)算CT值。以GAPDH作為內(nèi)參，以Caspase-3 mRNA/GAPDH mRNA來表示Caspase-3的表達(dá)水平，比值越高，則表示Caspase-3表達(dá)水平越高。

1.2.8 NF-κB及炎性因子TNF-α和IL-6的測定 采用電泳遷移率改變分析法 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測NF-κB，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)試劑盒檢測雪旺細(xì)胞中炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，具體操作根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。計(jì)量資料以 (x±s)表示，多組間比較行單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)2～3 d可見少量梭形細(xì)胞貼壁生長，約2周時(shí)梭形細(xì)胞可長滿培養(yǎng)皿。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示85%以上的細(xì)胞S100陽性，提示所培養(yǎng)細(xì)胞為雪旺細(xì)胞。

2.2 AGEs對雪旺細(xì)胞增殖、遷移能力及凋亡率的影響 不同干預(yù)條件的7組乳鼠雪旺細(xì)胞的增殖能力 (OD值表示)、遷移細(xì)胞數(shù)、凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，但不同濃度的BSA組間各個檢測指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)。(1)與空白對照組比較，各濃度BSA組干預(yù)后雪旺細(xì)胞的增殖能力比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);但是各濃度AGEs組干預(yù)后雪旺細(xì)胞，隨著AGEs濃度的增加，細(xì)胞的增殖能力減弱，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與相同濃度的BSA組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。(2)各濃度BSA組遷移細(xì)胞數(shù)與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);但是雪旺細(xì)胞在受到不同濃度的AGEs干預(yù)后，其細(xì)胞遷移數(shù)隨著AGEs濃度的增加而減少，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且與相同濃度的BSA組比較，在低濃度 (20 μg/ml)時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＞0.05)，但在 50 μg/ml、100 μg/ml AGEs干預(yù)后，其細(xì)胞遷移數(shù)較BSA組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。(3)各濃度BSA組干預(yù)后凋亡率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但是經(jīng)不同濃度的AGEs干預(yù)后，凋亡率逐漸增高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);與相同濃度的BSA組比較，各濃度AGEs組的凋亡率均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.3 AGEs對雪旺細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的影響 原代分離的雪旺細(xì)胞經(jīng)不同條件干預(yù)處理后，其Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 (以Caspase-3 mRNA/GAPDH mRNA表示)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。其中各濃度BSA組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);而隨著AGEs干預(yù)濃度的增加，Caspase-3 mRNA表達(dá)水平逐漸增高，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且與相同濃度的BSA組比較，各濃度AGEs組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 不同濃度的BSA和AGEs干預(yù)后雪旺細(xì)胞增殖能力、遷移細(xì)胞數(shù)、凋亡率及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的比較 (x±s)Table 1 Comparison of cell proliferation，migration，apoptosis rate and Caspases-3 mRNA of Schwann cells in different groups of BSA and AGEs

2.4 AGEs對雪旺細(xì)胞NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平的影響 各組雪旺細(xì)胞NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。其中，經(jīng)BSA干預(yù)雪旺細(xì)胞后NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);與BSA組比較，AGEs組NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而AGEs+抗RAGE抗體組的NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平與BSA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表2)。

表2 雪旺細(xì)胞NF-κB活性及TNF-α、IL-6水平比較 (x±s)Table 2 Comparison of NF-κB activity and level of TNF-α and IL-6 of Schwann cells

3 討論

人體內(nèi)的AGEs分外源性和內(nèi)源性兩類:外源性AGEs主要來自食物及煙草;內(nèi)源性AGEs是體內(nèi)還原糖的羰基與蛋白質(zhì)中的氨基與在無酶的條件下反應(yīng)，經(jīng)過一系列分子內(nèi)重排而形成［7］。AGEs與其受體結(jié)合后，通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激、激活NF-κB信號途徑等，刺激產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，這些因子在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［8］。目前研究已經(jīng)證實(shí)，AGEs參與了糖尿病血管、腎臟、視網(wǎng)膜等各種并發(fā)癥的發(fā)生，降低了患者的生活質(zhì)量［9］。近年來，AGEs對于糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用也得到廣泛的研究。在糖尿病患者和糖尿病實(shí)驗(yàn)動物的外周神經(jīng)中都檢測到了AGEs的存在。Migur等［10］在對8例2型糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的外周神經(jīng)取樣研究中發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)組織中存在大量的AGEs，其中神經(jīng)軸突和髓鞘處積聚最多。Wada等［11］建立的糖尿病小鼠模型中，在雪旺細(xì)胞、神經(jīng)軸突和神經(jīng)束膜內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了AGEs。

雪旺細(xì)胞是由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化而來的周圍神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘細(xì)胞，作為神經(jīng)干內(nèi)主要的非神經(jīng)元活性細(xì)胞，它能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有營養(yǎng)神經(jīng)、趨化和促進(jìn)再生神經(jīng)纖維成熟的功能［12］。本研究結(jié)果顯示，AGEs能夠抑制體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進(jìn)其凋亡，這就導(dǎo)致外周神經(jīng)脫髓鞘并抑制新生神經(jīng)纖維正常結(jié)構(gòu)的形成。另外，當(dāng)成熟的神經(jīng)纖維受損時(shí)，雪旺細(xì)胞能夠增生形成一個連續(xù)的柱狀結(jié)構(gòu)并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，誘導(dǎo)神經(jīng)再生［13-14］。因而AGEs誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞增殖能力降低也可能導(dǎo)致糖尿病患者的周圍神經(jīng)修復(fù)能力減弱。

如前所述，AGEs與其受體結(jié)合后，通過多種途徑參與到糖尿病各種慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中，增加NF-κB的活性是其重要途徑之一。NF-κB是氧化應(yīng)激過程中的一個關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，可調(diào)控炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄［15］。本研究結(jié)果顯示，AGEs可誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞中NF-κB的活性增高和炎性因子TNF-α及IL-6分泌增加，而抗RAGE抗體與AGEs同時(shí)孵育時(shí)則NF-κB的活性和炎性因子TNF-α及IL-6分泌均未見顯著增高，即抗RAGE抗體阻斷了AGEs的促發(fā)作用。這說明AGEs與RAGE結(jié)合后激活NF-κB，后者調(diào)控TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)，引起雪旺細(xì)胞內(nèi)部一系列炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞的損傷及增殖、遷移等能力的下降。由此可見，AGEs能夠通過促進(jìn)炎性反應(yīng)來損害雪旺細(xì)胞的功能，可能正是這種損害作用導(dǎo)致了患者周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)能力下降和再生功能障礙。這一發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了AGEs參與糖尿病周圍神經(jīng)病變的假設(shè)，因而抑制AGEs的生成或者阻斷其與RAGE的結(jié)合可能成為未來預(yù)防或治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的方向之一。

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