Wnt/β-catenin信號通路在高糖誘導足細胞轉分化中的作用機制研究

劉淑歌，賴德源

微量清蛋白尿是糖尿病腎病 (DN)最早的臨床表現，足細胞發生上皮-間葉細胞轉分化 (EMT)是導致蛋白尿的一個重要原因［1］，在 DN的發生發展過程起著重要作用［2-4］。Wnt/β-catenin信號通路可能通過其目的基因snail誘導阿霉素腎病小鼠足細胞發生EMT及蛋白尿［5］，在腎臟發育、腎臟腫瘤［6］中起著重要作用，但Wnt/β-catenin信號通路是否參與DN足細胞損傷目前尚不清楚。本研究通過觀察活化的βcatenin分子在高糖誘導足細胞EMT過程中的表達，探討Wnt/β-catenin信號通路在高糖誘導足細胞EMT中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，雌性，體質量150～180 g，購自中山大學實驗動物中心，實驗動物合格證號:4407208043，實驗動物使用許可證:SCXK(粵)2011-0029。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基 (Gibco，USA)，RPMI 1640無糖培養基 (Gibco，USA)，胰島素 -轉鐵蛋白 -硒(ITS) (美國 Gibco)，Anti-Nephrin antibody(Abcom，USA)，Anti-alpha smooth muscle Actin antibody(Abcom，USA)，beta-tubulin(Epitmic)，Non-phospho(Active)βcatenin(Ser33/37/Thr41) (D13A1)Rabbit mAb(CST，USA)，Rabbit polyclonal to Wnt-1(Santa cruz，USA)。其余材料均購自中國威佳公司。

1.3 方法

1.3.1 腎小球足細胞培養與處理 大鼠脫臼處死后于超凈臺內無菌取出雙腎，去除腎包膜，分離腎皮質，依次通過80目、150目、200目不銹鋼細胞篩網，收集200目不銹鋼細胞篩網上組織即為腎小球。75 cm2培養瓶預先鋪Ⅰ型膠原，將收集的腎小球種于培養瓶中，每瓶加完全培養基10 ml，5 d首次換液，7 d傳代，第14天完全分化可用。觀察細胞形態并采用間接免疫熒光法檢測nephrin和Wt-1的表達。為觀察高糖對足細胞EMT的濃度效應，設置正常糖組 (D-葡萄糖5 mmol/L)、高糖組 (D-葡萄糖15 mmol/L、30 mmol/L)，作用48 h;高滲對照組 (甘露醇25 mmol/L+D-葡萄糖5 mmol/L)。為觀察高糖對足細胞EMT的時間效應，將足細胞置于30 mmol/L高糖環境下作用0、12、24、48 h。為了解 Wnt/βcatenin信號通路是否參與該過程，檢測高糖環境下0、2、4、8、12、24、48 h足細胞Wnt-1及活化β-catenin的表達，再將足細胞置于加入DKK1的高糖培養基作用48 h，檢測nephrin及α-SMA的表達。

1.3.2 免疫印跡半定量檢測nephrin、α-SMA、活化β-catenin及Wnt-1的表達 RIPA裂解緩沖液提取各組細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。各組取等量上樣蛋白，加入預先制好的8%的SDS凝膠分離，而后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠 nephrin(1∶200)，α-SMA(1∶200)，β -catenin(1∶1 000)，Wnt-1(1∶200)，4 ℃搖床過夜。TBST洗滌3次，5 min/次;加入辣根過氧化酶標記的抗山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h。超敏發光液發光，曝光。β-tubulin作為內參照。采用Image J2X軟件分析灰度值。

1.3.3 間接免疫熒光 將各組完全分化的足細胞按5×104/孔接種于24孔板，至80%融合，無血清培養基同步化12 h，48 h后棄去培養基，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%triton-x100破膜8 min，5%牛血清清蛋白 (BSA)常溫封閉1 h，加入一抗nephrin(1∶60)，Wt-1(1∶60)，置于濕盒內4℃過夜;加入異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的熒光二抗，37℃避光1 h;二異丙醇胺 (DIPA)復染胞核。采用熒光顯微鏡進行觀察。

1.4 統計學方法 所有實驗重復3次取平均值，應用SPSS 13.0統計軟件包進行分析，計量資料以 (x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 足細胞原代培養 每只大鼠可收獲7.5×105個足細胞，熒光顯微鏡下觀察發現nephrin以顆粒狀及線狀表達于足細胞胞膜、胞質及胞核周圍，Wt-1表達于胞核 (見圖1)。

2.2 免疫印跡半定量結果

2.2.1 48 h后，正常糖組nephrin相對表達量為 (0.967±0.065)，15 mmol/L高糖組為 (0.771±0.068)，30 mmol/L高糖組為 (0.112±0.042)，高滲對照組為 (1.096±0.104)，差異有統計學意義 (F=106.848，P=0.000);正常糖組α-SMA相對表達量為 (0.360±0.023)，15 mmol/L高糖組為(0.430±0.008)，30 mmol/L高糖組為 (0.524±0.040)，高滲對照組為 (0.320±0.030)，差異有統計學意義 (F=18.149，P=0.001)。足細胞nephrin和α-SMA的表達與高糖呈濃度依賴性 (見圖2)。

2.2.2 30 mmol/L高糖組0 h時nephrin相對表達量為 (0.889±0.039)，12 h時為 (1.115±0.032)，24 h時為 (0.782±0.057)，48 h時為 (0.230±0.003)，差異有統計學意義(F=291.463，P=0.000);0 h時 α-SMA相對表達量為(0.069±0.006)，12 h時為 (0.184±0.005)，24 h時為(0.368±0.019)，48 h時為 (0.368±0.019)，差異有統計學意義 (F=528.710，P=0.000)。足細胞α-SMA的表達與高糖呈時間依賴性 (見圖3)。

2.3 高糖環境下，Wnt/β-catenin信號通路上游分子Wnt-1 0 h時相對表達量為 (0.028±0.003)，2 h時為 (0.065±0.005)，4 h時為 (0.053±0.009)，8 h時為 (0.082±0.021)，12 h時為 (0.070±0.010)，24 h時為 (0.472±0.025)，48 h時為 (0.338±0.030)，差異有統計學意義(F=286.848，P=0.000);Wnt/β-catenin信號通路中心分子活化β-catenin 0 h時相對表達量為 (0.002±0.000)，2 h時為 (0.009±0.005)，4 h時為 (0.012±0.003)，8 h時為(0.016±0.002)，12 h時為 (0.183±0.022)，24 h時為(0.618±0.036)，48 h時為 (0.034±0.002)，差異有統計學意義 (F=593.262，P=0.000)。高糖作用12 h后，足細胞Wnt-1及活化β-catenin表達開始升高，24 h時達到高峰(見圖4)。

圖1 足細胞原代培養結果 (間接免疫熒光)Figure 1 The results of podocyte primary culture

2.4 正常糖組nephrin相對表達量為 (0.885±0.072)，正常糖+DKK1組為 (0.917±0.006)，高糖組為 (0.307±0.015)，高糖 +DKK1組為 (1.693±0.140)，高糖 +BSA組為 (0.273±0.012)，差異有統計學意義 (F=199.355，P=0.000);正常糖組 α-SMA相對表達量為 (0.161±0.005)，正常糖 +DKK1組為 (0.186±0.008)，高糖組為(0.370±0.021)，高糖+DKK1組為 (0.137±0.011)，高糖+BSA組為 (0.389±0.008)，差異有統計學意義 (F=312.258，P=0.000)。DKK1有助于增加高糖誘導的nephrin的表達，降低α-SMA的表達 (見圖5)。

圖2 圖2不同糖濃度足細胞nephrin和α-SMA的表達Figure 2 Expression of nephrin and α-SMA in podocyte under different glucose concentration

圖3 30 mmol/L高糖組足細胞nephrin和α-SMA在不同時間點的表達Figure 3 Expression of nephrin and α-SMA in podocyte under 30 mmol/L glucose at different time points

3 討論

足細胞EMT是近年來提出的足細胞損傷的一個重要機制，在DN中的作用越來越受到重視。足細胞EMT特征性表現是上皮細胞標記物如nephrin表達降低，而間葉細胞標記物α-SMA表達增多。nephrin是一個重要的腎小球裂孔膜蛋白，在腎小球濾過屏障中起著重要作用;α-SMA是肌動蛋白家族的成員之一，在正常成年人主要表達于平滑肌細胞及肌成纖維細胞，是一個常用的EMT標記物［7］。

圖4 高糖環境下對足細胞Wnt-1及活化β-catenin在不同時間點的表達Figure 4 Expression of Wnt-1 and active β-catenin in podocyte under high glucose at different time points

圖5 DKK1對足細胞nephrin及α-SMA蛋白表達的影響Figure 5 Effects of DKK1 on the expression of nephrin and α-SMA in podocyte

在各種損傷刺激下，足細胞根據遭受損傷的嚴重性及損傷的持續時間發生一系列適應性變化，包括肥大、去分化、脫落、凋亡［8］。最早足細胞可能通過肥大來代償損失的功能，如果損傷繼續發展，足細胞則發生EMT從而逃避凋亡，使足細胞失去高度特異性的上皮細胞標記物，并獲得新的間葉細胞標記物。與腎小管上皮細胞不同，足細胞發生EMT后并非轉化為成纖維細胞，而是獲得了運動能力，使足細胞易于從腎小球基底膜脫落，這就導致足細胞濾過屏障的功能不全及蛋白尿的產生。隨著機體損傷程度的加重或損傷時間的延長，足細胞逐漸發生凋亡或丟失，從而加劇蛋白尿并導致腎小球硬化。本研究結果顯示，15 mmol/L和30 mmol/L高糖組48 h后足細胞上皮細胞標記物nephrin表達逐漸降低，間葉細胞標記物α-SMA表達逐漸增加，說明在高糖作用下足細胞發生表型轉化。足細胞表型轉化是一個可逆的過程，早期給予合理干預可以逆轉足細胞損傷［9］，深入了解足細胞表型轉化的作用機制具有非常重要的意義。

Wnt/β-catenin信號通路在腎臟發育中起重要作用，但在成熟腎臟Wnt/β-catenin信號通路處于靜止狀態，幾乎檢測不到［10］。病理狀態下，Wnt/β-catenin信號通路可重新活化，參與許多慢性腎臟病的發生，如多囊腎［11］、腎臟腫瘤［6］、腎臟間質纖維化及蛋白尿等［5，12-17］。在單側輸尿管梗阻 (UUO)模型中，腎小管上皮細胞表達Wnt-4蛋白增多，胞質中去磷酸化β-catenin增多，目的基因Twist等表達上調，腎小管上皮細胞逐漸失去ZO-1、E-Cadherin等上皮細胞標記物，重新獲得間葉細胞標記物，如α-SMA、成纖維細胞特異性蛋白-1(FSP-1)等，細胞外基質成分Ⅰ型膠原纖維增多［15］。對鏈脲佐菌素 (STZ)大鼠、db/db小鼠、AKtia小鼠DN模型的研究均表明，在DN中有Wnt信號通路的過度活化［16］;有臨床研究表明，DN患者足細胞FSP-1表達增多，且FSP-1陽性的足細胞數目與DN蛋白尿的程度呈正相關［3］;DN患者病理切片可見足細胞Wnt-1表達增高，伴隨著nephrin表達的降低［6］，說明在DN的發生發展過程中普遍存在Wnt/βcatenin信號通路的活化。本研究結果顯示，高糖作用12 h后，足細胞Wnt-1及活化β-catenin表達開始升高，于24 h時到達高峰，48 h后開始下降，提示高糖環境促使足細胞Wnt/βcatenin信號通路活化。DKK1可與Wnt/β-catenin信號通路的共輔助受體低密度脂蛋白相關蛋白5/6結合，阻斷Wnt信號通路，是該通路的一個特異性抑制劑。既往研究表明，阻斷Wnt/β-catenin信號通路能減輕腎小管上皮細胞的表型轉化［13］，逆轉阿霉素腎病小鼠模型中足細胞的損傷，減輕蛋白尿［18］。本研究結果顯示，DKK1對正常糖作用下的足細胞表型無明顯影響，但有助于增加高糖誘導的足細胞nephrin的表達，降低α-SMA的表達，提示阻斷Wnt/β-catenin信號通路有可能成為DN治療的一個新的方向。但本研究為體外實驗，阻斷Wnt/β-catenin信號通路能否改善或逆轉DN患者的足細胞損傷、DKK1是否可以作為DN治療的新手段等仍需進行體內實驗進一步驗證。

綜上所述，高糖可誘導體外原代培養的足細胞發生表型轉化，Wnt/β-catenin信號通路可能參與了該過程。進一步深入研究Wnt/β-catenin信號通路與足細胞EMT之間的關系將有助于為扭轉DN早期足細胞損傷提供依據，為其治療提供一個新方向。

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