發酵乳制品中益生菌生存能力影響因素的研究進展

文 / 周曉丹 張 昊 郭慧媛 任發政

（中國農業大學教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室）

1 前言

在世界范圍內，消費者對食品影響健康的意識逐漸增強，這也使得功能食品的消費成為一種趨勢。2000年、2005年和2010年，功能性食品在全球的市場份額分別為330 億、735 億和1 670 億美元[1]。益生菌食品被視為功能食品市場的一個重要組成部分，占市場總量的60%～70%。益生菌是可能存在于宿主（人類/動物）腸道中的活的微生物（不包括霉菌），具有確定的一種或多種益生功能。乳酸桿菌和雙歧桿菌是目前發酵乳制品中最常使用的菌種。發酵乳制品中很多常見的益生功能都來自于益生菌，其中普遍承認的作用有抗癌、抗誘變、刺激免疫系統（免疫調節）、抗感染，降低血清膽固醇，緩解乳糖不耐癥以及增強營養[2]。

根據食品法典委員會的定義，發酵乳制品是一種“通過發酵鮮奶得到的乳制品，產品可能會經過合適的微生物的作用而使組分改性，從而降低了pH值，產生凝乳現象（等電點沉淀）”[3]。發酵乳制品在全世界廣泛制造，大約有400 個通用名稱被應用到傳統和商業產品中。但這其中實際的產品種類可能只有少數幾種，酸奶是世界上最受歡迎的發酵乳制品[4]，其它的發酵乳制品還有發酵奶酪，基于發酵乳的飲料（如酸乳酒，馬奶酒，Ayran酸奶汁，Doogh酸奶飲料），經發酵的冰淇淋，發酵乳制品甜點以及酸奶油等。

對于一個益生菌產品，發揮其益生功能，直到保質期最后益生菌仍保持較強的活力，是其品質最關鍵的評價準則[5，6]。雖然全球沒有公認的產品中益生菌的最小含量標準，但通常濃度為106CFU/mL和107～108CFU/mL（或CFU/g）分別是被普遍接受的最小和令人滿意的劑量水平[3，5，7]。在發酵乳制品生產和貯存過程中，益生菌的生存能力受配方、生產工藝和環境條件等諸多因素的影響[8～10]。本文對這些影響益生菌生存能力的主要因素進行了概述。

2 益生菌菌株和發酵菌株間的生物關系

由于益生菌無法在充分發酵的同時又保證發酵乳制品令人滿意的感官品質，所以通常會在其中添加傳統的發酵菌種，這被稱為“支持培養”或“輔助培養”。益生菌在牛奶中生長緩慢會提高有害微生物生長的風險，而且若菌株生長不良，也可能會產生不愉快的味道[5]。只添加益生菌的發酵乳制品，其培養時間可能會延長到8～24 h，而使用傳統發酵菌株只需要3～4 h[11]。因此，發酵功能食品最需要關注的就是發酵劑和益生菌之間的相互作用。

針對不同的益生菌，發酵菌株與益生菌菌株之間會呈現協同或拮抗兩種作用，這取決于二者的種類以及組成成分和工藝條件[12]。通過產生一些促進益生菌生長的物質或消耗某些抑制因素，發酵菌株可以為益生菌提供一個良好的生長環境。然而，益生菌的生存可能會受到包括乳酸、過氧化氫、細菌素，甚至是揮發性化合物在內的發酵菌株代謝產物的影響[13]，保加利亞乳桿菌在發酵過程中會急劇產酸，然后在冷藏過程中繼續緩慢產酸（后酸化過程）。上述現象均會導致酸奶產生不愉快酸味，同時降低益生菌的生存能力[5]。因此，在決定發酵乳制品培養成分時，最主要的原則是選擇兼容且合適的益生菌混合物和發酵劑。

選擇用于食品生產的益生菌菌株應考慮其對產品的兼容性和拮抗性兩個標準[4]。乳酸桿菌和雙歧桿菌是目前用于發酵益生菌酸奶最重要的菌種。兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌、約氏乳桿菌、洛德乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、代田乳桿菌、乳酸腸球菌、小球菌等目前都可用于生產益生菌發酵乳制品，其產品包括酸奶、酪乳、酸乳酒和馬奶酒等[14，15]。益生菌在產品中（對pH值、總酸含量、氧氣毒性、凍結、低溫或相對較高的儲存溫度等惡劣條件的抵抗）和生活消費條件下的耐受性依賴于菌株本身的特異性[16～19]。雙歧桿菌是嚴格厭氧菌，高氧含量會影響其正常生長和活性，然而由于其對于酸、低pH值和分子氧等有害環境因素的良好耐受能力，乳雙歧桿菌雖然并不來自于人類，卻是發酵乳制品中最常用的雙歧桿菌菌株[20]。

3 發酵乳制品中對益生菌有害的因素

3.1 低pH值和總酸含量

低pH值和總酸含量是影響發酵乳制品中益生菌生長和穩定性的重要因素。嗜酸乳桿菌最適生長的pH值為5.5～6.0，而雙歧桿菌為6.0～7.0[9]。當pH值低于5.5時，嗜酸乳桿菌細胞的生長會明顯減慢[7]。然而，雙歧桿菌屬的某些菌種對酸的耐受能力是有菌株特異性的。氫離子會中斷通過細胞膜的質量傳遞，并導致細胞酸性饑餓，從而對益生菌細胞造成損害[5]。發酵乳制品中過低的pH值可能會引起非游離態有機酸濃度的升高，從而增強了這些酸的殺菌作用。

發酵乳制品中的酸含量與氧化還原電位值呈正相關，而氧化還原電位值越高對雙歧桿菌的活性越不利[12]。通常在發酵乳制品中，相比于總酸含量，益生菌對pH值相關的壓力更為敏感（pH值和pH值下降速率）。總酸含量主要是在儲存過程中對益生菌活性的影響較大[21，22]。

3.2 溶解氧和過氧化氫

乳酸桿菌可以好氧或厭氧并嚴格發酵，而雙歧桿菌則嚴格厭氧并可分解糖類[9]，因此，分子氧不利于益生菌的生長和存活。然而，對氧的敏感性在不同菌種和菌株之間差別很大。一般情況下，乳酸桿菌本質上是微量需氧微生物，對氧的耐受性強于雙歧桿菌。

氧在三個方面影響益生菌的培養。首先，它對一些細胞有直接毒性；第二，某些益生菌培養在有氧條件下，特別是像保加利亞乳桿菌，會產生對益生菌細胞有毒性的過氧化物，這也是嗜酸乳桿菌在ABY型酸奶（特指其發酵所用菌種為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的酸奶）發酵和儲存過程中活性損失的主要原因[23，24]；第三，各種成分氧化作用產生的自由基（如脂肪）對益生菌細胞也是有毒性的[5，22]。有許多方法可以降低發酵乳制品中的氧含量，最主要的便是在真空下完成發酵。使用真空包裝和對氧氣滲透性低的包裝材料，在牛奶中添加抗氧化劑和除氧劑（如抗壞血酸），并控制生產過程，這樣可以使溶解氧的含量達到最小值[25]。

3.3 添加劑

目前乳品行業中使用的食品添加劑會顯著影響發酵劑（如嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸乳球菌）和益生菌（如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌）的生長和活性[26]。這些添加劑包括鹽（NaCl和KCl）、糖（蔗糖和乳糖）、甜味劑（安賽蜜和阿斯巴甜）、芳香化合物（二乙酰、乙醛和乙偶姻）、天然色素、調味劑、調味著色劑、乳酸鏈球菌素、那他霉素和溶菌酶等[4，26]。

研究證明，益生菌對乳品添加劑的耐受性比發酵菌更強[27]。當NaCl達到一定的濃度（如0.5%～1.0%）時即會對益生菌生長和活性產生刺激作用[28]。添加精油也不利于益生菌的生存，在儲存期間，濃度為0.2%的薄荷和新塔花香精即可導致嗜酸乳桿菌LA-5和乳雙歧桿菌BB-12活菌數量的顯著減少[4]。

4 發酵乳制品中促進益生菌生長的因素

4.1 生長因子和生長促進劑

由于缺少非蛋白氮和一些維生素，以及β-半乳糖苷酶和蛋白水解酶缺乏活性，乳酸桿菌，特別是雙歧桿菌在牛奶中容易生長不良[18，25]。為解決生長緩慢的問題，通用的一個很好的方法就是使用各種生長因子和生長促進劑來強化牛奶，如酪蛋白、乳清蛋白水解物、L-半胱氨酸、酵母提取物、葡萄糖、維生素、礦物質和抗氧化劑等。這些補充物對益生菌的存活有顯著的促進作用[25]。由于蛋白質衍生物對細胞的營養價值，以及降低培養基的氧化還原電位和增加培養基的緩沖能力等特性，其促進益生菌生長的作用最為顯著?！耙嫔笔遣灰紫氖称放淞?，會被腸道內的有益菌選擇性代謝以促進其生長。它們大多是二碳到十碳的低聚糖類化合物，在很大程度上能抵抗胰腺和刷狀緣酶的消化，有助于保持益生菌在產品及腸道內的生存能力[21]。

4.2 產品中的益生菌保護因素

產品的緩沖能力，以及其固體基質特性可以顯著影響益生菌細胞的生存能力。由于其將pH值維持在了較高水平，因此增加牛奶的緩沖能力可增強益生菌的活性。此外，高緩沖能力產品的pH值在發酵和冷藏過程中下降緩慢，使益生菌細胞的存活率更高[13，28]。奶酪和酸奶緩沖能力很強，益生菌在其中的生存能力也遠高于發酵乳飲料。另外還可以通過添加小麥、大麥和麥芽提取物到牛奶中來增加產品的緩沖能力[29]。

與液體食品不同，產品中的固體基質，如酸奶或奶酪的凝膠結構，則通過減少其暴露于有害因素中的機會來保護益生菌細胞[4，22]。這些基質可作為物理或化學屏障阻斷H+和有機酸這類水相環境的不利因素[28]。另有報道指出，通過在食品原料中形成致密基質，乳酸菌胞外多糖也可提高益生菌在胃腸道中的生存能力[30]。

5 發酵乳制品加工工藝對益生菌的影響

5.1 發酵溫度和時間

發酵溫度和時間是影響益生菌生存能力最重要的因素。雖然嗜酸乳桿菌可在高達45 ℃條件下生長，但其最適溫度為40～42 ℃，雙歧桿菌最適生長溫度為37～41 ℃，發酵菌種則為42～45 ℃[31]?；旌弦嫔囵B，特別是發酵菌種與益生菌共同培養時，選擇適當溫度更加重要。研究表明，在ABY型培養組分中，發酵溫度過高，益生菌生存能力越低，這是因為高溫下發酵菌種比益生菌生存能力更強[24，31]。

5.2 接種條件

在進行不同種類的發酵時，接種條件也不同，包括發酵后接種、連續發酵和單獨發酵。益生菌發酵乳制品中添加發酵劑可提高發酵速率，并產生酸奶特有的風味和質地。然而，益生菌和發酵菌種共同培養會降低益生菌的生存能力，這是因為發酵過程中發酵菌種生長更快，而且會產生一些物質抑制益生菌生長。為克服此問題，可在發酵后加入益生菌，即“發酵后接”，使用這種方法，培養時間顯著縮短[4，32]。此外，也可以讓益生菌和發酵劑先分別單獨生長，然后再將兩者混合[5]。這樣可以使益生菌增殖到理想數量，又不會影響發酵劑的發酵過程。然而，一些證據表明，發酵后接種益生菌，會降低其耐受性，并使其暴露于環境壓力中，這又會反過來導致益生菌細胞生存能力大量損失[5，22，28]。

在連續發酵中，益生菌比發酵菌種增殖更快，或二者在適宜溫度下同時增殖。在“兩步式發酵”過程中，初始為益生菌培養，然后再由一種或兩種發酵劑完成發酵，使益生菌在最終達到停滯期或在初始階段達到對數期。此過程結束時會得到一個相當高的益生菌數量，而發酵時間會稍長[33]。連續發酵過程可以改變發酵溫度，37 ℃開始讓益生菌生長，然后逐步升溫至40 ℃、42 ℃或44 ℃來改善風味和質地[22]。

接種量會影響益生菌生存能力、發酵時間以及最終產品的感官品質。益生菌與發酵劑間的接種比率是一個關鍵因素。發酵劑和益生菌之間以較低比例接種會延長發酵時間，感官性狀也不理想。相反較高比例則會使發酵菌種大量生長，保加利亞乳桿菌的過度酸化現象也會降低益生菌生存能力[4，13，22]。然而，在缺乏營養的培養基上過度提高接種量可能會導致相反結果，由于營養競爭和拮抗作用，發酵劑生存能力會下降。除了接種量，培養液中的活細胞濃度也應加以考慮，接種量恒定時，增加培養液的活細胞濃度，產品中細胞數量也會提高[13]。

5.3 儲存溫度和時間

由于溫度對細胞存活有影響，因此發酵乳制品的貯存溫度會影響益生菌的生存能力，以及發酵菌種代謝物的類型和濃度[34]。有報道指出ABY型酸奶在2 ℃條件下存儲20 天，其嗜酸乳桿菌LA-5活性達到最高，而乳雙歧桿菌BB-12在8 ℃條件下儲存會獲得最大活性。已經證實雙歧桿菌細胞在低儲存溫度下（2 ℃以下）抵抗力較低[35]。所以益生菌發酵乳制品應存儲在冷藏溫度下，優選4～5 ℃。

存儲時間與益生菌的生存能力成一定的比例，因為時間延長增強了有害因素對益生菌的不利影響。盡管益生菌對于惡劣環境的抵抗力有菌株特異性，發酵乳制品pH值低于4.2時（如許多發酵乳飲料），要實現每個益生菌菌株活菌數量都保持在107CFU/mL以上，且保質期超過21 天是很難的[34]。相比發酵乳飲料，具有高pH值（4.4～4.6）和高緩沖力的益生菌酸奶，則可以實現更長的保質期。高于5 ℃存儲保質期超過約3 周的ABY型酸奶，可能會導致保加利亞乳桿菌大量生長，這種后酸化作用會顯著降低益生菌的生存能力[34]。

6 小結與展望

發酵乳制品是健康食物，益生菌會產生額外的健康功效。益生菌發酵乳制品是現在最受歡迎的食品。對于這種產品，發酵是關鍵環節，它是由益生菌單獨或輔助發酵劑共同作用實現的。益生菌被添加到發酵乳制品中，其許多特性與最終產品的質量和屬性有關。這些特性包括益生菌細胞的安全性，生產和儲存過程中益生菌的生存能力，益生菌與發酵劑的酸化速率，以及其生產出具有優良感官品質和合理價格的產品的能力?，F有的大量研究都是針對產品配方和生產工藝的優化，而益生菌在發酵乳制品中的生存能力更是保證產品品質和性能的關鍵所在。未來發展前景必將是基于分離新的益生菌菌株，改造修飾現有益生菌和發酵劑并不斷完善配方和工藝，以獲得其良好的生存活力以及更好的健康功效，關于諸如益生菌和益生元微膠囊化等新技術的研究也會受到特別關注。

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