煙草早花機理研究進展

楊靜 陳杰 郭鴻雁 陳建軍 賀廣生 鄧世媛 王維

（1.華南農業大學農學院，廣州 510642；2.廣東煙草韶關市有限公司，韶關 512000）

煙草早花指煙草植株未能達到正常生長應具有的高度和葉數就現蕾開花。發生早花的煙株，過早地從營養生長轉入生殖生長，導致生長勢弱，葉數減少，葉片窄小，葉片的產量和質量降低［1，2]。國內外煙葉生產均存在煙草早花問題［3，4]，嚴重影響著煙葉的生產。研究煙草早花問題需要了解植物開花機理，近百年來，人們在開花生理生化方面進行了大量的探索，提出了光周期理論、開花素學說、養分分配假說，并對光周期誘導、溫度影響等因素進行了大量研究。在進入20世紀70年代之后植物發育研究陷入低谷［5]，直到1990年，Yanofsky等［6]成功地分離了花器官發育控制基因AGAMOUS，從此打破了植物發育生物學研究的沉寂，植物發育生物學的機理研究由以生理生化為主轉變到以分子生物學及生理遺傳學為主。目前有關植物開花的研究，國內多集中在品種、溫度和光照三個方面［7]，側重于生理生化并且缺乏系統全面的研究；國外的研究則比較詳盡，且已由生理機理的研究深入到分子機理的研究。對煙草而言，由于種植區域廣、栽培品種多、栽培過程相對繁瑣且各地不一致，造成煙草早花的原因錯綜復雜，煙草早花的研究至今仍未能建立一個統一的理論體系。分子生物學的發展促進了煙草成花基因的研究，也使得對煙草早花的研究更為深入和系統。總的來說，煙草成花機理十分復雜，煙草是如何獲得信號、何時進入花的發生和發育階段仍有待進一步研究，煙草成花的分子機理研究將推動煙草早花研究的進一步發展［8]。

1 煙草成花的生理與分子機理

1.1 煙草的成花決定

植物開花需要建立在成花決定態之上［9]。成花決定態指細胞具有分化為花的能力但還未開始花的分化時所處的狀態。當成花決定態細胞達到一定數量時就可以啟動花的發生，開始花的發育［10]。有觀點認為，在正常生長條件下 ，發育的遺傳特性有著決定性影響，煙草在形成花芽之前必須分化出可預測的節和節間數。另一種觀點認為：煙草的整個生育期按營養生長期至生殖生長期的順序逐步完成［11]。李文安等［12]通過培養黃花煙草（N.rustica）葉肉原生質體表明，從愈傷組織可直接產生正常的花與花蕾，而不需要先形成莖與葉片，且不同光周期處理對花芽的形成沒有影響。另外，他們在利用煙草不同發育時期，植株上不同部位的薄層組織配合一定的培養基進行組織培養的試驗中發現，營養生長時期主莖薄層組織無花芽分化能力，隨著植株生長發育進入現蕾期、主莖薄層從花序頂端向下逐步出現花芽分化能力，在形成花芽的盛期時，幾乎主莖的所有節位均有形成花芽分化能力，植株在開花盛期時，主莖表皮薄層形成花芽的能力，由下部節位向上部節位開始逐漸減弱，至青果期主莖表皮薄層已完全失去分化花芽的能力，只有營養芽出現，花序區內的主莖已無分化花芽的能力。而花序枝梗，小枝梗卻表現出強有力的花芽分化現象［13]。綜上各種觀點及結果表明，細胞需要達到一定的狀態才能感受外界刺激，進行花芽分化，但如何界定這個狀態至今仍未有明確統一的判斷標準。

1.2 調控開花的主要基因

擬南芥是所有植物中開花基因人們研究得最為透徹的一種植物，現已深入到各途徑各基因的分子機理研究，在擬南芥上的一系列研究結果表明，開花主要是體內抑制狀態在環境因子或體內發育信號的誘導下逐步解除的過程，解除方式可通過多種途徑進行。通常將擬南芥的開花歸結為4條主要途徑［16]：光周期途徑、春化作用途徑、赤霉素途徑和自主途徑，與開花時間相關的基因通過這四條途徑共同調控花分生組織特征基因的表達從而促使植物開花。調控過程，如圖1所示。

光周期途徑的主要調控基因是CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）、LEAFY（LFY）和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）。經過光刺激和生物節律調控之后，CO誘導其下游的基因FT、LFY（LEAFY）和SOC1，從而促進植物開花，其中最為主要的基因有FT、SOC1和LFY，它們整合了各途徑對開花時間的影響［17-19]。春化作用途徑中的主要調控基因有：FRIGIDA（FRI）、FLOWERING LOCUS C（FLC）、VERNALIZATION 1（VRN1）、VERNALIZATION 2（VRN2）和VERNALIZATION INSENSITIVE3（VIN3）。FRI能促進FLC的表達，抑制開花［20，21]。FLC能直接抑制FT與SOC1的表達，從而造成植物晚開花［22]。而自主途徑與春化作用途徑都能通過抑制FLC基因的表達來促進開花［23]。FT蛋白被認為是一直在尋找的成花素，近年來的研究表明FT蛋白需要在FD的配合下整合調控莖尖端花芽分化［24]。大量研究表明，FT同源基因在擬南芥、水稻、柑橘、番茄、白楊、牽牛花、梨、向日葵和葫蘆中的過量表達都能促進開花，預測了FT基因具有促進開花的保守功能［25]。

表1 擬南芥中與開花相關的基因

擬南芥開花基因的研究開啟了植物開花基因研究的大門，在對擬南芥開花基因研究的基礎上，通過對擬南芥開花基因同源基因的搜尋，水稻、谷物、果樹中與開花相關的基因的研究也已取得了很大的進展，與開花相關的基因相繼被克隆［26，27]。

目前對煙草中存在的與開花時間相關基因的研究比較少。Kelly等［37]從煙草中克隆了FLORICAULA（FLO）和LFY的同源基因NFL1和NFL2（Nicotiana FLO/LFY），但試驗證明它們與植株開花并無直接關系。Smykal等［38]從煙草中克隆了與開花時間相關的基因Nicotiana SOC1（NtSOC1）和NicotianaFUL（NtFUL），并經過試驗表明它們與光周期特性有關，其過表達能引起煙草提早開花。王小彥等［39]通過低溫等處理煙草后，分析了低溫誘導煙草早花中的SOC1以及一些與代謝相關的酶、部分植物生長物質的基因表達變化。李元元［40]根據不同植物MADS-box家族基因的保守區序列，設計簡并引物，從烤煙品種NC82中克隆出了MADS-box家族的同源基因。

表2 其他作物中與擬南芥開花基因具有同源性的基因

1.3 影響開花的生理信號物質

調控植物開花的生理信號物質多種多樣，但其作用機制仍有待進一步研究。傅永福等［41]研究歸納了多種成花生理信號物質，這些信號物質可分為促進型和抑制型，同一信號物質在不同植物的成花誘導過程中，或起促進作用，或起抑制作用，或二者兼而有之，這取決于植物的特性、信號物質的濃度及其狀態（自由態或束縛態），不同植物或同一植物不同發育時期對同一物質的敏感性不同。Eriksson等［42]通過研究赤霉素促進開花基因的表達證明，在沒有受到溫度和光照誘導的條件下，擬南芥可以通過自身合成的赤霉素促進開花。Martinez等［43]通過研究開花基因表達量的變化，證明水楊酸能調節植物開花，缺乏水楊酸能導致植物晚開花，并且水楊酸在光周期途徑與自主途徑中有一定的調節作用，但不影響與開花時間相關的基因的表達。上述研究表明，不同的生理信號物質對成花的影響程度、調控方式存在差異，有的物質能夠直接影響與開花時間相關的基因的表達，有的則通過影響其他生理機能間接調控開花。成花信號物質種類繁多且機理復雜，各種成花信號物質是怎樣調控植物開花時間的仍有待更深入的研究且與分子技術相結合。

2 影響煙草開花的環境因素

2.1 光照

光對植物開花的影響包括光周期的影響、光質的影響和光照強度的影響。人們對煙草光周期特性進行了大量的研究，但由于品種、區域、試驗方法各不相同，不同人的試驗結果不同，對同一品種，由于地區和試驗方法差異，說法也存在差異。曹顯祖等［44]研究認為，烤煙品種K326為日中性。顏合洪等［45]通過試驗表明K326對光周期的反應具有短日性，經短日照處理后，煙株現蕾明顯提前。在影響開花時間的因素中，光周期起著重要的調控作用。研究認為，藍光和遠紅光比紅光更易促進植物開花［46]。Eskins［47]的研究顯示，藍光能促進擬南芥提早開花，紅光則不能。魏勝林等［48]研究顯示，藍光下培育的菊花花期可提前12 d，紅光處理提前6 d，藍光促進花芽分化和開花比紅光效果明顯。肖金香等［49]通過在煙株旺長后期覆蓋遮陽網研究表示，煙株生長中后期降低光照強度會使烤煙現蕾、開花期推遲。而生產上煙草移栽季節遇低溫陰雨天氣易早花有可能是因為光照不足所引起。光對煙草各個時期的影響如何值得研究和探討，各品種煙草的光周期性，尤其是各地區主栽烤煙品種的光周期特性仍需進行針對性的研究，只有針對各地、各品種進行具體試驗，才能有效指導生產。

2.2 溫度

有關溫度對煙草開花的影響，大多數研究認為低溫對煙草早花具有誘導和促進作用［50]。韓錦峰等［51]以K326為材料，研究了低溫對煙株頂芽發育及頂芽內激素含量的影響，結果表明到第6片真葉時，K326才對低溫敏感，且低溫誘導只有持續到7葉時才能有效。金磊等［52]對低溫誘導后烤煙莖端分生組織的花芽分化過程的研究則發現，在相同時間的苗期低溫逆境下，其他品種可提前開花以保持生育周期正常完成，而K326沒有早花，但整個生育周期都會受到不良影響。這與陳衛國等［53]的烤煙品種耐寒性研究結果一致。不過也有試驗結果表明，溫度對烤煙成花的影響無本質作用且沒有直接關系［54]。總的來說，低溫誘導煙草早花需要建立在一定的條件下，煙苗的葉齡、溫度的范圍、誘導的時間長短以及煙草品種的耐寒性對是否造成早花均有影響，溫度對煙草早花的影響與光對煙草生長發育的影響一樣，仍需進一步系統的研究。

2.3 水分和養分

一般來說，適當的干旱有利于花芽分化，土壤漬水或干旱、移栽時的肥害、過量施用化學藥劑、某些微量元素的過量吸收等都可以造成一定程度的早花［55，56]。有研究顯示，低水平的氮有助于一些長日照作物的提早開花；而重金屬元素鉛和鐵、鉬等微量元素可影響光周期誘導及小麥等的春化作用［57]。洪鯤等［58]通過試驗表明，不同配比的N、P、K、Ga會對馬纓杜鵑花芽發育和花期產生影響，適量的施用N、P、K、Ga能調節植物的花期。借鑒其他作物的施肥研究不難發現，通過調控水肥管理或許能有效協調煙草的開花時間，目前這方面的研究很少。任雅君等［59]在對煙草噴施葉面肥KH2PO4的研究中發現，2.0% KH2PO4不利于煙草開花，0.5% KH2PO4有助于促進煙草開花，因此，當煙草種植中施用葉面肥時需注意把握施用量，以達到保證煙株正常生長并適時發育的目標，防止因化肥施用不當引起煙草早花。

3 煙草早花基因的研究技術

隨著分子生物技術的不斷發展，在了解了擬南芥等植物的開花基因序列及功能的基礎上，可通過已知的基因序列設計引物，通過RT-PCR（reverse transcription PCR）及電泳檢測技術，檢測基因的相對表達量，通過測序分析未知基因片段與已知基因是否具有同源性、再通過克隆和轉基因的方式與功能基因突變體相比較，檢測該基因是否具有影響植物開花的功能，這些研究已得到了廣泛的運用［60-63]。但是，由于植物生長發育是一個十分復雜的過程，涉及到眾多基因的表達和調控，以往的研究局限于某一種或某一類基因的行為和功能，不能監測該基因或該類基因與其他基因的互作，無法從整個基因組水平進行研究，利用基因芯片技術，可以自動、快速、平行地檢測目的材料中成千上萬個基因的表達情況［64]。利用基因芯片檢測作物中相關基因的表達的方法是多種多樣的。許州達等［65]在分析了小麥與水稻基因的同源性后，利用水稻的基因芯片檢測了小麥耐旱的相關基因的表達。曾黎瓊等［66]通過GenBank搜索已發布的花序發育基因序列，設計特異性的引物，采用PCR法擴增，獲得了相應的基因片段后利用這些基因片段制備基因芯片，然后用此芯片與已標記的非洲菊cDNA雜交，用以分析同一基因在非洲菊不同發育時期的表達情況和同一基因在不同肥料條件下的表達情況，但自行設計合成芯片的技術要求與合成成本較高。目前一些生物技術公司已合成了煙草基因芯片，其中包含了上萬個煙草的基因，但很多基因的功能都還未知，其中許多與開花相關的基因的研究仍需要通過合成引物，利用RT-PCR檢測、測序、序列比對等技術進行進一步的探索，以明確煙草中存在的開花基因。

4 小結

早花問題一直困擾著煙葉的生產，傳統的研究思路單從環境因素和生理生化角度進行分析，但由于不同的產區氣候條件的不同、栽培的煙草品種不一致而使研究結果難以定論。但是，就生產需要和目前的研究成果來說，有針對性地就某個地區、某特定品種進行早花研究仍然很有必要且需要更為深入的研究。結合各煙區氣候條件不同，主栽品種不同，栽培習慣不一樣，大田生產中煙草早花的預防需要結合各煙區實際情況。對煙草早花生理的理論研究則需要突破地域、品種的限制，除了對品種、光照、溫度等因素進行單一的研究之外，還應將影響煙株生長發育的各個因素整合起來，結合地區、品種得到系統的研究結果，為實踐提供有價值的參考信息。

分子生物學的發展推動了遺傳育種研究的發展，研究煙草的開花基因，不僅能從分子機理角度解釋調控開花的主要因素和過程，將各個途徑整合成一個相互聯系的系統。同時，若能在了解煙草開花基因的基礎上利用分子設計育種技術選育出抗早花的煙草品種，對大田生產來說將是預防煙草早花更為直接、簡潔的手段。值得注意的是，已知的開花基因的同源基因并不一定具有調控開花的作用，且不同作物中，同源基因的調控機理是存在一定差異的［68，69]，利用已知的開花基因尋找其他作物開花基因的研究需要通過基因克隆、測序以及轉基因等手段調整目標基因在植物中的表達，再對其表型進行觀測才能得出可靠結論。在煙草開花基因的研究基礎上，考慮到基因表達最終是通過蛋白質的形式來表現，而且由于密碼子的簡并性，單憑DNA序列的測定不能完全說明問題，因此，對煙草進行蛋白質組的研究并將其與基因研究結果進行對比分析，能使研究結果更為可靠，但目前的研究水平離煙草開花蛋白的研究還有很長的一段路要走。

開花基因的研究為煙草早花的研究打開了一扇新的大門，但是，分子水平的研究只有在結合生理水平研究的基礎上，將形成早花的生理機制、分子機制和環境因素相結合，才能全面真實的闡述并解決早花問題。隨著煙草基因組測序的完成，我們相信煙草分子研究的時代已經到來，生理生化研究未能解決的問題，將在傳統研究結合分子機理的研究中找尋到答案。

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