巴西橡膠樹HbNTL1基因啟動子的克隆與序列分析

康桂娟 黎瑜 曾日中 聶智毅

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所 農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室和省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，儋州 571737）

植物特有的NAC（NAM，ATAF1/2和CUC2）轉錄因子組成了植物基因組中最大的轉錄因子家族之一［1]。膜結合NAC轉錄因子是植物NAC轉錄因子家族中一類C端具有跨膜結構域的轉錄調控因子，該類膜結合NAC蛋白依靠此結構錨著在細胞膜或內質網膜上［3-8]。到目前為止，已經在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine maxL.）、玉米（Zea mays）、葡萄（Vitis viniferaL.）、水稻（Oryza sative）和毛果楊（Populus trichocarpa）等多種陸生植物中發現具有多個NTLs［1，4，6，8-11]。

NAC家族轉錄因子廣泛參與調控植物體生長發育、生物和非生物脅迫應答以及激素信號轉導過程［1，12-13]。越來越多的研究發現膜結合NAC轉錄因子的表達受非生物脅迫的誘導，在植物的生長發育和逆境脅迫應答中發揮重要作用［1，6，8]。Kim等［5，8]研究發現擬南芥NTLs基因受多種生物和非生物脅迫條件誘導，并且可以調節擬南芥的開花時間。研究結果顯示，水稻OsNTL基因與擬南芥相似，都可以被多種非生物脅迫誘導表達［8]。Puranik等［1]研究發現谷子膜結合SiNAC基因可能與脅迫和生長發育調控相關，可以被滲透脅迫、鹽脅迫、乙烯和茉莉酸甲酯誘導表達。本實驗室已經從橡膠樹中克隆了HbNTL1基因的全長cDNA序列，在此基礎上，利用基因組步移（Genome Walker）方法克隆了該基因的啟動子序列，并通過生物信息學軟件分析其核心啟動子結構、順式作用元件及其生物學功能，旨在為進一步研究HbNTL1轉錄因子的表達調控以及其在橡膠樹抵御逆境脅迫中的作用提供信息和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）無性系熱研7-33-97種植在中國熱帶農業科學院實驗農場，幼葉液氮研磨后凍存在-80℃，用于基因組DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 巴西橡膠樹基因組DNA的提取 橡膠樹基因組DNA的提取采用改進的CTAB法［16]。

1.2.2HbNTL1基因啟動子的克隆 啟動子克隆采用基因組步移的方法，Genome Walker文庫由本研究組夏可燦等按Universal Genome WalkerTMKit（Clontech）使用說明書構建［17]。根據HbNTL1轉錄因子的cDNA序列，設計一對巢式PCR特異性引物：5'-CTCTGTGGCCCGGTTTGTCTTGGAACCA-3'（NTLGSP1）和5'-GTGAAGCCGCAGAATCACCACGTGCCA-3'（NTLGSP2）。上游引物為Universal Genome WalkerTMKit自帶的接頭引物AP1和AP2，以PvuII，EcoRV，StuI和DraI酶切連接的產物為模板，反應程序為：94℃ 25 s，72℃ 3 min，7個循環；94℃ 25 s，67℃3 min，32個循環。

1.2.3 生物信息學分析 利用Softberry（http：//linu x1.softberry.com/berry.phtml）網站的TSSP（植物啟動子預測）數據庫分析了所克隆得到的可能為巴西橡膠樹HbNTL1轉錄因子基因啟動子的序列；利用Berkeley Drosophila Genome Project（BDGP）的在線軟件Neural Network Promoter Prediction Promoter（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預測核心啟動子區域和轉錄起始位點；利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和搜索植物順式作用元件數據庫PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對啟動子序列中可能存在的順式作用元件進行分析［18]。

2 結果

2.1 橡膠樹HbNTL1基因啟動子的克隆

根據橡膠樹HbNTL1基因的cDNA序列設計一對巢式PCR特異性引物NTLGSP1和NTLGSP2，進行PCR擴增，兩輪PCR擴增后得到約2.0 kb的條帶（圖1），將PCR產物連接pMD18-T vector，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆進行測序。將測序結果與已知序列比對分析，去除載體、接頭引物和與讀碼框重疊序列，得到橡膠樹HbNTL1基因上游非編碼區1 718 bp的序列。

2.2 HbNTL1基因啟動子的生物信息學分析

在線軟件TSSP預測結果表明，HbNTL1基因5'非編碼區序列存在一個可能的啟動子區，位置在1 513 bp處，一個對應的TATA框，位置在1 484 bp處，一個增強子CAAT-box，在1 436 bp處（圖2）。BDGP在線軟件Neural Network Promoter Prediction Promoter預測HbNTL1基因的核心啟動子序列和轉錄起始位點，結果（圖2）顯示，HbNTL1基因5'非編碼區序列中含有真核生物典型的核心啟動子區域（1 473-1 522 bp），其中+1位置的堿基A是轉錄起始位點，位于翻譯起始位點（ATG）上游206 bp處。HbNTL1基因的轉錄起始位點堿基為A，TATA-box在轉錄起始位點的-30 bp處，符合高等植物啟動子的基本結構特征。

利用在線軟件PlantCARE和PLACE對HbNTL1基因啟動子序列中可能含有的順式作用元件進行分析，結果發現，除具有12個拷貝的TATA-box和CAAT-box外，還具有9個赤霉素、脫落酸和茉莉酸等激素響應元件（ABRE、GAREAT、 P-box、TATC-box和TGACG-motif）、56個逆境脅迫響應元件（ACGTATERD1、ARE、CCAATBOX1、CURECORECR、DOFCOREZM、HSE、MYBCORE、TC-rich repeats、W-box）、6個光順式反應元件（GAG-motif、GATA-box和G-box）、28個組織特異性表達元件（CACTFTPPCA1、GTGANTG10、POLLEN1LELAT52、ROOTMOTIFTAPOX1和RY-repeat）以及2個拷貝的晝夜節律控制元件（Circadian）等（表1）。

表1 HbNTL1啟動子區域主要順式作用元件分析

3 討論

NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄調控因子，在植物的生長發育、器官建成、激素調節以及生物和非生物脅迫應答等方面具有重要作用［1，2]。但是對于NAC類轉錄因子的研究還主要集中在基因的克隆與轉基因表達分析上，而對他們的上游調控因子和下游靶標基因都不是很清楚。本研究在已知巴西橡膠樹膜結合NAC轉錄因子HbNTL1基因cDNA序列的基礎上，利用Genome Walker的方法獲得了其5'調控序列1 718 bp，通過在線軟件的預測與分析該序列具有真核生物典型的核心啟動子區域和大量的順式作用元件。HbNTL1基因啟動子序列中存在多個激素響應元件、光作用順式元件和組織特異性表達元件，因此，HbNTL1的表達可能受到光信號和激素的調控，并且存在組織特異性。

HbNTL1基因啟動子序列中含有大量的逆境脅迫響應元件，占到了總數的50%左右。MYBCORE和MYCCONSENSUSAT元件在HbNTL1基因啟動子序列中共發現有15個拷貝，這些元件分別是MYB和MYC轉錄因子的識別位點，與其相應轉錄因子在ABA信號通路和非生物脅迫應答中具有重要作用［19，20]。ABRE元件是脫落酸響應元件，在干旱、脫水、鹽和低溫等非生物脅迫時誘導植物體內積累脫落酸，從而調控相關基因的表達［21]。啟動子分析發現HbNTL1基因啟動子序列中包含了14個拷貝的DOFCOREZM元件，該元件是Dof 轉錄因子的識別位點，調控保衛細胞特異基因的表達，在植物防御過程中具有重要作用［22]。在HbNTL1基因啟動子中還發現有14個拷貝的W-box元件，該順式作用元件是WRKY轉錄因子的識別位點。植物特有的WRKY基因通過與順式作用元件W-box特異結合調控下游目標基因表達，與植物的防御反應、逆境應答、衰老信號和生長發育等密切相關［23，24]。ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、MYCCONSENSUSATHSE和W-box等反應元件在其他植物脅迫逆境相關NAC轉錄因子基因的啟動子區域都有報導［1，2，10，25-28]。HbNTL1基因啟動子序列中這些反應元件的大量存在表明，HbNTL1可能是一個逆境脅迫相關NAC轉錄因子（stress-responsive NAC），在橡膠樹抵抗逆境脅迫的生理過程中具有重要功能。本實驗室將利用巴西橡膠樹HbNTL1基因的5'調控序列，通過酵母單雜交系統篩選調控HbNTL1轉錄因子的上游調控因子，從而進一步研究HbNTL1的表達調控及其在橡膠樹逆境脅迫中的作用。

4 結論

本研究利用Genome Walker 的方法克隆了巴西橡膠樹膜結合NAC轉錄因子HbNTL15'調控序列1 718 bp，軟件預測與分析該序列具有真核生物典型的核心啟動子區域和大量的順式作用元件，其中逆境脅迫相關元件占到50%，HbNTL1可能是一個逆境脅迫相關NAC轉錄因子，在橡膠樹抵抗逆境脅迫的生理過程中具有重要功能。

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