轉基因水稻華恢1號檢測用質粒標準分子研制

李亮 王晶 臧超 隋志偉 趙正宜

（中國計量科學研究院，北京 100013）

《2011年全球生物技術/轉基因作物商業化態勢》（年報43）作者、ISAAA主席Clive James博士強調：2011年轉基因作物種植面積較2010年增長8%，即1 200萬hm2；來自全球29個國家的農民中約有1億人次種植了轉基因作物，且累積種植面積超過12.5億hm2（超過美國或中國25%的國土面積）［1]。

中國在1997年就已經開始有轉基因植物獲得安全證書，到目前為止已有8種植物獲批。最具備里程碑意義的是：2009年11月27日通過了對轉基因Bt水稻和植酸酶玉米的生物安全認證，這一舉措對轉基因作物在中國、亞洲乃至全世界的應用產生重大影響［2]。其中“華恢1號（TT51-1）”的獲批意味著轉基因水稻朝著水稻原產國和水稻消費大國——中國的商業化生產大門邁出了實質性的一步。

隨著轉基因水稻的獲批，轉基因作物及產品的定性與定量檢測隨之而來。質粒分子具有易于富集，非植物來源，可以高效、快捷獲得無限穩定量的優點，同時也解決了難以獲得植物陽性基因組DNA對檢測所帶來的問題［3]。轉基因水稻華恢1號質粒標準分子（pTT51）按照國家一級標準物質技術規范（JJF 1006-94）［4]進行研制，可用于轉基因定量檢測和安全評價、實驗室質量控制等領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉基因水稻華恢1號種子由上海交通大學提供；pEASY-T3質粒載體購自北京全式金公司。

1.1.2 試劑與儀器 TaqMan?Universal Master Mix購自Applied Biosystems公司；正反向引物、TaqMan探針均由Invitrogen上海公司合成；基因組提取試劑盒Wizard?Magnetic DNA Purification System for Food procedure和質粒提取試劑盒購于Promega公司；實時熒光定量PCR儀為LightCycler?480 II；紫外分光光度計DU-800購自貝克曼公司；電泳儀和凝膠成像系統采用BioRad公司產品等。

1.2 方法

1.2.1 質粒分子的制備 通過查閱轉化體的相關資料，選取華恢1號轉化體特異性（外源基因）序列，長120 bp，單拷貝［5]；選取RBE4基因片段，長106 bp，單拷貝［6]作為內標準基因序列（圖1）。

圖1 轉化體特異性序列和內標準基因序列

構建得到的質粒pTT51-1轉化入大腸桿菌受體菌JM109中，以氨芐青霉素為篩選標記，確認陽性克隆后在LB培養液中進行大量培養，然后利用質粒提取試劑盒進行提取和純化。

分別采用適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳法、紫外分光光度法判斷DNA的純度及濃度，以及選擇3家測序實驗室來驗證質粒片段的正確性。

1.2.2 實時熒光定量PCR反應的引物和探針 試驗共需要兩對引物和相應的探針，引物和探針序列設計參考文獻［7] ，由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，序列見表1。

1.2.3 特異性檢測 為驗證質粒標準分子的特異性，采用不同作物轉化體的內源、外源特異性引物分別對質粒分子進行擴增。選取轉基因玉米BT176、轉基因大豆MON89788和轉基因棉花MON1445三種轉化體，分別采用內、外源引物對3種轉化體基因組及質粒分子進行擴增。

表1 外源基因和內標準基因的引物及探針序列

1.2.4 替代性研究 實時熒光定量PCR試驗時，完全依賴質粒標準分子而不使用其它標準物質是不可能的。問題在于質粒和基體在定量中是否可以替代，因為不可能保證每個質粒分子同植物基因改良樣品的拷貝數相比都產生11的結果，因為相關效率和轉基因作物的外源基因片段和內標準基因片段也許發生了變化［7]。對質粒與基體進行可替代性研究，采用qPCR方法，即指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。采用外源基因和內標準基因擴增的Cq值［8]（每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環）相比的方法，通過qPCR隨機取樣進行分析。主要考察標準曲線的擴增效率和線性擬合度（R2）。

1.2.5 均勻性分析 均勻性分析同樣采用qPCR技術，在DNA序列的固有特征一致的前提下，試驗證明批次間的序列比值沒有差異。通過組間方差和組內方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統性差異，二者之比小于統計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的［9]。

pTT51共制備了500管標準分子，每管500 μL，隨即取樣單元為15管，分別標記1-15。15管pTT51進行實時熒光PCR的方法進行擴增。

1.2.6 穩定性檢驗 穩定性是指在規定的時間間隔和環境條件下，標準物質的特性量值保持在規定范圍內的性質［8]，即用來描述特性量值隨時間變化的。穩定性分析方法：采用外源基因和內標準基因擴增的Cq值相比的方法，通過qPCR隨機取樣進行分析。

1.2.7 定值和不確定度評估 定值結果通過實時熒光定量PCR方法計算Cq比值為參考值，然后對pTT51治理分子標準物質進行測量不確定度評估。

2 結果

2.1 質粒

2.1.1 質粒分子構建 將PCR擴增轉化體目標DNA片段（120 bp）和內標準基因DNA片段（106 bp）通過重疊技術構建到載體pEASY-T3上，命名為pTT51，物理圖譜見圖1。

2.1.2 質粒分子的純化和質量分析 構建得到的質粒轉化入大腸桿菌受體菌中，菌種保藏在-70℃冰箱，以載體氨芐青霉素（Amp）抗性為篩選標記。質粒的大量制備由保藏的菌種開始，首先使菌種復壯，劃平板挑取單克隆菌落在LB培養液中進行大量培養，然后采用質粒提取試劑盒Promega A2393進行提取和純化。

用紫外分光光度法測定所提DNA的濃度與純度，OD260/OD280值應在1.8-2.0之內，OD260/OD230值應該大于2。測定結果（表1）顯示均在要求范圍內。

表1 pTT51質粒分子的紫外測定結果

通過測序分析來驗證構建質粒片段的正確性及連入的拷貝數，采用三家實驗室的測序，即上海英濰捷基生物技術有限公司、生工生物工程有限公司和北京諾賽基因組研究中心。測序結果表明連入片段與圖1一致，并且為單拷貝連入。

2.1.3 特異性檢測 選取轉基因玉米BT176、轉基因大豆MON89788和轉基因棉花MON1445三種轉化體，分別采用內、外源引物對3種轉化體基因組及pTT51質粒分子進行擴增，結果（圖2，圖3）顯示，pTT51內、外源引物可擴增出目的條帶，為陽性，而其它作物檢測結果及空白對照（NTC）為陰性，因此說明pTT51質粒分子的內、外源基因針對其它引物特異性良好。

2.2 替代性研究

2.2.1 PCR擴增效率的分析評價 采用方差分析的F分布假設檢驗。一般認為在95%的置信區間內，取α=0.05，即臨界P值。若最后算得的P值>0.05，即在F分布的95%的區間內，認為兩組數據沒有差別。若最后算得的P值<0.05，即在小概率區間內，認為兩組數據有顯著性差別。

通過基因組DNA和質粒DNA擴增效率的比較（表2）發現，兩者的內外源擴增效率并沒有顯著的差別（P均大于0.05），說明質粒DNA的擴增效率與基因組DNA是相似的。

表2 基因組DNA和質粒DNA擴增效率的比較

2.2.2 線性擬合度的分析評價 由試驗數據可知，華恢1號基體DNA和質粒DNA的R2在0.992-1.000之間。通過基因組DNA和質粒DNA的R2比較（表3），發現兩者的內源線性擬合度和外源線性擬合度均無顯著差異（P>0.05），可以互相替代為陽性標準物質，進行定量檢測。

表3 基因組DNA和質粒DNA 的R2比較

通過試驗數據分析，分別對轉基因水稻華恢1號基體和質粒分子的擴增效率和線性擬合度分別進行了可替代性的評價，結果發現基體和質粒分子具有相似的擴增效率和線性擬合度。在實際定量操作中可以互相替代作為陽性標準物質。

2.3 均勻性檢驗

將外源和內源Cq值相比后，采用F檢驗的方法對實時定量PCR所獲得的數據進行分析，結果（表4）表明F

表4 pTT51管間均勻性分析結果

2.4 穩定性檢驗

一般短期穩定性研究4周，長期穩定性進行6個月或1年。按ISO導則35［9]關于穩定性評價的方法對標準物質的長期穩定性進行評價。

短期穩定性分析：分別存儲在-20℃、4℃或25℃，達1、2、3、4周，各3管樣本，每管分成3個子組（N=3，n=3）。一個存儲在70℃的同種樣本做參照。每個樣本3次重復，通過qPCR對兩個序列含量進行分析，結果見表5。

表5 pTT51短期穩定性統計結果

長期穩定性試驗：將凍存管放置在-70℃（參照溫度），-20℃，達1、2、3、6個月進行。3個不同的管在每個溫度下通過qPCR同時分別進行3個重復的測試（5 μL pDNA每個PCR反應）。數據經格拉布斯檢驗無離群值需要剔除，已統計6個月，見圖9。自由度n-2=3，P=0.95，t=2.352，b1=0.0002，t*S（b1）= 0.004642，故此b1

2.5 定值

定值結果通過qPCR的方法計算Cq比值為參考值。

2.5.1 參考值的確定 將測定的pTT51質粒分子的外源基因片段與內源基因片段之比（n=44）的結果為0.967，相對標準偏差RSD為0.013。

2.5.2 參考值的不確定度評定 標準物質的參考值確定后，還要對測量結果的不確定度進行分析。總不確定度由3部分組成：第一部分是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統計方法計算出；第二部分是通過對測量影響參數和影響函數的分析估計出；第三部分是物質不均勻性和物質在有效期內的變動性所起的不確定度。

A類不確定度的評估（UA）：該分量是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統計方法計算出的不確定度。

B類不確定度評估（UB）：通過對測量影響因素的分析，得出B類不確定度的分量（UB）。該分量與標準物質研制的整個過程有關，本研究主要考慮移液器等所有過程。

移液器引入的不確定度，按照試驗方法中涉及的移液器以及所用體積。移液器帶來的不確定度主要由各種移液器的校準偏差引入，包括使用到的各種量程的移液器偏差。

因此urel（v）=0.0016

標準物質不均勻性引起的不確定度的評定（UH）：由本質粒的研制報告可知，樣品經均勻性檢驗后是均勻的，所以此部分的貢獻為：

標準物質穩定性引起的不確定度（UT）：按照ISO導則35的方法，對標準物質的長期穩定性進行檢驗，選取0，1，2，3，6三個月的外/內源Cq值比值進行計算。由于斜率變化是不顯著的。因而未觀測到不穩定性。St=Sb·t=0.012

合成標準不確定度UC為：

將以上4個部分的相對不確定度合成，在擴展因子為2時，得到合成標準不確定度為：

U=0.024

3 討論

植物組織的難獲取時，或者不頻繁使用標準品時，質粒分子可以方便而迅速的獲得，并且達到檢測目的。目前市場上僅有4種質粒分子標準物質，分別用于檢測：轉基因玉米MON810（ERM-AD413）、轉基因玉米NK603（ERM-AD415）、轉基因大豆356043（ERM-AD425）、轉基因玉米98140（ERMAD427）。相對已經上市的近200轉化體而言，質粒標準分子的市場研發前景是巨大的。質粒標準分子已經成為解決轉基因作物檢測有效性的新途徑之一。

我國轉基因生物標識制度中，未設置標識閾值。目前我國已發布的轉基因檢測標準大都是通過常規PCR方法進行定性檢測，或者利用實時熒光PCR方法進行檢測但僅做定性判斷。而在實施強制性標識的大部分國家和地區，都設置了標識閾值，并將實時熒光定量PCR方法作為轉基因檢測的標準化方法。如歐盟、日本、韓國規定，對食品及飼料中轉基因成分標識的閾值分別為0.9%、5%與3%，并建立了相應的定量檢測方法。面對不斷發生的轉基因事件、針對國際轉基因成分標識的現狀，我國迫切需要加大開展轉基因生物定量檢測技術研發的力度，建立完善、規范的定量檢測技術體系，并在此基礎上加快開展定量檢測標準的研制。

4 結論

本研究嚴格按照國家一級標準物質制備，通過qPCR的方法計算Cq比值為參考值，結果為0.967。經不確定度評價，pTT51質粒分子標準物質的擴展不確定度為0.024，可以替代基因組作為陽性標準品應用于實驗室質控、含量檢測及貿易爭端等領域。

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［9] ISO Guide 35：2006. Reference materials-General and statistical principles for certification. International Organization for Standardization（ISO）, Geneva, 2006.