原生質(zhì)體融合技術(shù)選育分解草酸乳酸菌菌株的研究

張禹 毛淑紅 路福平 聶實(shí)踐

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.北京百林康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京 100069）

人體缺乏降解草酸的酶，體內(nèi)的草酸一般通過(guò)腸道內(nèi)微生物降解。1985年Allison［1]首次篩選出具草酸分解能力的產(chǎn)甲酸草酸桿菌，之后又發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、雷氏普羅威登斯菌和乳酸菌具有不同程度的草酸分解能力。Lung［2]首次得到分解產(chǎn)甲酸草酸桿菌分解草酸的關(guān)鍵酶基因oxc和frc。國(guó)內(nèi)郭照宇［3]對(duì)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌進(jìn)行篩，選得到37株具有草酸分解能力的乳酸菌，趙樹(shù)田［4]對(duì)10種可制作酸奶的乳酸菌體外降解草酸能力評(píng)價(jià)，得到具有最高分解能力的是乳雙歧桿菌。而現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)得到的分解草酸的腸道微生物耐氧能力較差，為培養(yǎng)和生產(chǎn)微生態(tài)制劑帶來(lái)了困難。為克服該問(wèn)題，Turroni等［5]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)參與草酸代謝的草酰輔酶A脫羧酶和甲酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的克隆與表達(dá)做了相關(guān)研究。但轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品領(lǐng)域存在著安全問(wèn)題，而原生質(zhì)體融合技術(shù)更為安全，同時(shí)操作更為簡(jiǎn)便，可以更快捷地得到重組菌。

本研究在國(guó)內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，選取具有草酸分解能力的乳雙歧桿菌和具有耐氧特性的嗜酸乳桿菌作為親本，通過(guò)雙親滅活進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選可以在有氧環(huán)境生長(zhǎng)并具有分解草酸能力的菌株

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactisDSM 10140）購(gòu)于中國(guó)普通微生物保藏管理中心。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusTCCC11275）保藏于天津科技大學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基、溶液和試劑 乳雙歧桿菌液體完全培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖5 g/L，K2HP40.45 g/L，KH2PO40.33 g/L，氯化銨1 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，L-半胱氨酸0.5 g/L，蒸餾水1 L，pH自然。

MRS液體培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO42 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 mL/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，pH自然。

再生培養(yǎng)基：半固體MRS培養(yǎng)基（不含吐溫80）中添加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2.5%的明膠，濃度為20 mmol/L MgCl2，濃度為0.5 mol/L的蔗糖。

草酸培養(yǎng)基：草酸鈉2.5 g/L，葡萄糖1.5 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母提取物0.5 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO42 g/L，硫酸銨2 g/L，硫酸錳0.025 g/L。

原生質(zhì)體穩(wěn)定液PB［6]：0.02 mol/L HEPES，pH值為7.0，添加濃度為1 mmol/L的MgCl2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的明膠，濃度為0.3 mol/L棉籽糖或濃度為0.5 mol/L的乳糖。

溶菌酶溶液：用原生質(zhì)體穩(wěn)定液PB配制成一定質(zhì)量濃度的溶菌酶溶液，用一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。

聚乙二醇 PEG 6000：用原生質(zhì)體穩(wěn)定液 PB 配制成一定質(zhì)量濃度的的溶液115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 分別取菌種乳雙歧桿菌DSM 10140和嗜酸乳桿菌TCCC11275按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%接種于乳雙歧桿菌液體完全培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2 原生質(zhì)體制備與再生 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期15 mL菌液離心3 500 r/min，并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液PB洗滌兩次，用原生質(zhì)體穩(wěn)定液PB稀釋至106-107個(gè)/mL，用完全培養(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)入9.0 cm培養(yǎng)皿中，加入一定質(zhì)量體積的溶菌酶溶液處理一定時(shí)間，原生質(zhì)體穩(wěn)定液PB洗滌兩次，用再生培養(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 原生質(zhì)體滅活 高溫滅活：取乳雙歧桿菌原生質(zhì)體細(xì)胞懸液5 mL在不同溫度熱水浴中，不同時(shí)間滅活后用再生培養(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。紫外滅活：取嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體細(xì)胞懸液5 mL于9.0 cm滅菌平板中，置15 W紫外燈下，距離為30 cm照射不同時(shí)間后用再生培養(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 原生質(zhì)體融合 將滅活后兩親本原生質(zhì)體懸液在離心管中等體積混合，于4℃冷凍離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min，然后加入不同配比質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的PEG6000，融合前需使親本的原生質(zhì)體細(xì)胞濃度達(dá)到106-107個(gè)/mL，混勻后放入15℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫?fù)u床中，10 min以待融合；取出融合后的原生質(zhì)體懸液4℃冷凍離心后用PB緩沖液離心洗滌兩次，以將融合劑洗凈，將洗滌后的原生質(zhì)體重懸于PB緩沖液中，得到融合后的原生質(zhì)體用再生培養(yǎng)基傾注法測(cè)定細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 計(jì)算公式 原生質(zhì)體形成率、原生質(zhì)體再生率、原生質(zhì)體滅活率和融合率計(jì)算公式參考文獻(xiàn)［7] 。

1.2.6 分解草酸測(cè)定方法 將測(cè)試菌株轉(zhuǎn)接到草酸培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)5 d后，使用高效液相色譜法檢測(cè)草酸培養(yǎng)基發(fā)酵前后的草酸含量，高效液相色譜法條件如下。色譜柱：C18柱5 μm，250×4.6 mm，pH范圍：2-10，流動(dòng)相：2% H3PO4的去離子水∶甲醇（V/V）=99.5∶0.5，檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm，流速：0.5 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體制備條件的確定

選擇原生質(zhì)體最佳的制備條件不僅要使原生質(zhì)體制備率達(dá)到最高，同時(shí)還要考慮原生質(zhì)體再生率不能過(guò)低，因此由表1、表2、表3結(jié)果可知乳雙歧桿菌的最佳原生質(zhì)體制備條件：溶菌酶濃度為6 mg/mL，酶作用溫度為37℃，酶作用時(shí)間為25 min。嗜酸乳桿菌的最佳原生質(zhì)體制備條件：溶菌酶濃度為12 mg/mL，酶作用溫度為37℃，酶作用時(shí)間為30 min。

表1 乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體制備溶菌酶濃度

表2 乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體制備溶菌酶作用溫度

表3 乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體制備溶菌酶作用時(shí)間

2.2 雙親本原生質(zhì)體滅活劑量的確定

原生質(zhì)體紫外滅活和熱滅活的試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表4、表5、表6。為保證原生質(zhì)體的滅活率為100%，最后確定嗜酸乳桿菌的紫外滅活時(shí)間為100 s，乳雙歧桿菌的高溫滅活溫度為65℃，時(shí)間為70s。

2.3 原生質(zhì)體融合條件的確定

融合條件是得到融合子的關(guān)鍵因素，主要研究了PEG6000 濃度、 融合溫度、 融合時(shí)間和無(wú)機(jī)離子濃度對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響。

表4 嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體紫外線滅活劑量

PEG可以使原生質(zhì)體膜之間有效接觸，有效地誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合［8]。由表7可知，融合率隨PEG6000濃度升高增加到5.0%當(dāng)濃度超過(guò)50%時(shí)，融合率下降到3.2%。因此選擇PEG6000濃度為50%作為原生質(zhì)體融合時(shí)的PEG濃度。

表5 乳雙歧桿菌原生質(zhì)體高溫滅活溫度

表 6 乳雙歧桿菌原生質(zhì)體高溫滅活時(shí)間

表7 PEG濃度對(duì)融合率的影響

溫度在一定程度上影響原生質(zhì)體融合率，較高的溫度可以增加性細(xì)胞膜流動(dòng)性，降低PEG 黏度，有助于原生質(zhì)體的融合。由表8可知，融合溫度上升到30℃時(shí)，原生質(zhì)體融合率提高到5.5%。溫度繼續(xù)升高后，融合率降低至2%。因此選擇30℃作為融合溫度。

表8 融合溫度對(duì)融合率的影響

PEG融合處理時(shí)間大多數(shù)情況為 1-10 min，由于PEG 對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體失活不能再生［9]。由表9 可知，隨著融合時(shí)間增加到 7min時(shí)，融合率提高到6.0%，當(dāng)融合時(shí)間繼續(xù)增加到11 min 時(shí)，原生質(zhì)體的融合率則降為 4.8%，因此為了獲得最大的融合率選擇7 min作為原生質(zhì)體的融合時(shí)間。加入一定濃度的Ca2+和Mg2+在原生質(zhì)體融合過(guò)程中可以促進(jìn)融合。

表9 融合時(shí)間對(duì)融合率的影響

由表10、表11結(jié)果可知，選擇融合率最高時(shí)的濃度為0.02 mol/L的CaCl2和濃度為0.5 mol/L 的MgCl2作為原生質(zhì)體融合時(shí)的Ca2濃度和Mg2+濃度。

表10 CaCl2濃度對(duì)融合率的影響

表11 MgCl2濃度對(duì)融合率的影響

2.4 融合子的篩選

在有氧條件的草酸培養(yǎng)基中，親本乳雙歧桿菌由于不耐氧無(wú)法生長(zhǎng)，嗜酸乳桿菌由于不具有分解草酸的能力也無(wú)法生長(zhǎng)，只有融合后完全繼承親本特性的融合子才能生長(zhǎng)。在296株融合子中有57株可以在有氧條件下的草酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使用高效液相色譜法對(duì)培養(yǎng)基中檢測(cè)培養(yǎng)基接種前后的草酸含量進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)，篩選出分解草酸能力較高的菌株SZY1-1、SZY1-4、SZY1-7、SZY2-1、SZY2-2和SZY3-4，見(jiàn)表12。

3 討論

原生質(zhì)體融合可以使兩親本細(xì)胞隨機(jī)融合，有效地篩選具有雙親特性的融合菌株，羅紅霞等［10]對(duì)乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LN1#）雙親滅活進(jìn)行原生質(zhì)體融合得到在高溫條件下產(chǎn)酸較強(qiáng)低，溫條件下產(chǎn)酸較弱的融合菌株。黃明深［11]利用有芽孢的整腸生菌株（Bacillus licheniformis）與無(wú)芽孢的保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus）作為親本，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到了乳酸產(chǎn)量高于親本菌株的融合菌株。原生質(zhì)體融合的篩選方法是得到融合菌的重要環(huán)節(jié)，比較有效的是使用抗生素標(biāo)記篩選，但在益生菌研究領(lǐng)域抗生素標(biāo)記的使用卻存在著安全問(wèn)題。本研究雙親滅活原生質(zhì)體融合后利用耐氧特性和耐草酸生長(zhǎng)特性的進(jìn)行篩選，不需要引入抗生素標(biāo)記，可直接作為安全益生菌用于預(yù)防和治療結(jié)石病。

表12 融合子分解草酸能力測(cè)定

本研究原生質(zhì)體融合率偏低，還需進(jìn)一步研究提高，以篩選得到草酸分解能力高于親本的融合菌株。張莉滟等［12]使用電融合技術(shù)對(duì)雙歧桿菌和熱滅活的乳桿菌進(jìn)行融合，通過(guò)生長(zhǎng)特性以及初步生化試驗(yàn)鑒定得到融合子，雖然通過(guò)電融合的方法提高融合率，但在篩選方法上還不夠完全。周正紅等［13]對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體的進(jìn)行了電融合的研究，融合率可達(dá)60%，相對(duì)于PEG誘導(dǎo)的融合率顯著提高，后續(xù)研究可以對(duì)原生質(zhì)體電融合方法進(jìn)行探討，以提高融合率得到更多高效分解草酸的融合子。

4 結(jié)論

本研究確定了原生質(zhì)體融合最佳條件為50%的PEG 6000，融合溫度30℃，融合時(shí)間為7 min，CaCl2濃度為0.02 mol/L，MgCl2濃度為0.5 mol/L，在此條件下融合率可達(dá)7.6%。篩選出一株草酸分解率為13.4%并可以在有氧條件下生長(zhǎng)的融合子。

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