FTO基因單核苷酸多態性與2型糖尿病發病風險的相關性研究

胡嘉樂黃婉嫻高洋朱安娜,孫敏英,楊學習★

?論 著?

FTO基因單核苷酸多態性與2型糖尿病發病風險的相關性研究

胡嘉樂1黃婉嫻1高洋1朱安娜1,2孫敏英1,2楊學習1★

目的探討FTO（fat mass and obesity associated）基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）與中國人群Ⅱ型糖尿病（Type Ⅱ Diabetes Mellitus, T2DM）易感性的關系。方法利用Sequenom MassArray?iPLEX系統對238例T2DM患者及239例健康對照的FTO基因單核苷酸多態性位點rs8050136進行基因分型，并對檢測結果根據共顯性、顯性模型、超顯性和隱性模型進行χ2檢驗和非條件Logistic回歸分析。結果FTO基因rs8050136位點在病例組和對照組的基因型頻率分布差異在顯性模型和超顯性模型中有顯著性（χ2= 8.603，P= 0.003；χ2= 5.428，P= 0.02）。相對CC基因型而言，CA雜合型和CA-AA基因型均能增加T2DM發病的危險性，（OR=1.751, 95%CI: 1.129～2.717,P=0.012;OR=1.915, 95%CI: 1.241～2.954,P=0.003）；而兩組間等位基因頻數分布也有顯著性差異（χ2= 10.614,P= 0.001），相對于C位點而言，A位點是T2DM的危險等位位點，（OR=1.933, 95%CI: 1.298～2.880,P=0.001）。結論FTO基因單核苷酸多態性rs8050136與T2DM的發病風險相關，CA雜合型和CA-AA基因型可顯著增加T2DM的發病風險。

FTO；單核苷酸多態性；Ⅱ型糖尿??；易感性

無論是在發達國家還是發展中國家，糖尿病正以迅速發展的勢頭成為現代社會的流行病，是繼腫瘤、心腦血管疾病之后第三位威脅人類健康的非傳染性重大疾病。WHO公布，至2000年全世界約有1.71億糖尿病患者，預計2030年全球的糖尿病患者總數將達到3.66億[1]。目前全球糖尿病患者已超過1.2億人，我國患者人群居世界第二[2]，據國家衛生部調查顯示，我國每天約新增3000例，每年約增加120萬糖尿病患者，其中約95.00%為Ⅱ型糖尿?。═ype ⅡDiabetes Mellitus, T2DM）患者[3]。

T2DM具有發病的隱匿性，相當多的患者是因為出現并發癥的臨床表現才被確診有糖尿病。多數患者病程較長，隨著病情的進展常出現全身多個臟器的損害，嚴重者則因糖尿病并發癥而致殘和死亡。糖尿病不僅給患者造成痛苦，也給家庭和社會帶來沉重的負擔。

T2DM是胰島素抵抗和β細胞分泌缺陷導致高血糖的代謝性疾病，是一種典型的多基因遺傳性疾病，是環境因素和遺傳因素共同作用的結果。至今，T2DM還沒有充分明確的致病機制。家族聚集性、同卵雙生子發病的一致性較高以及在某些種族人群中的高發病率均提示T2DM具有明顯的遺傳易感性。

作為第三代遺傳標記，單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）高密度存在于全基因組范圍。SNP是指基因組內某一特定核苷酸位置上存在2種（或2種以上）不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1%。在人類基因組中，絕大多數SNP在一個位點僅有2種等位基因，因此通常所說的SNP是指在某一核苷酸位置上的雙等位基因（biallelic）改變。SNP與第一、第二代遺傳標記相比，其數量豐富，穩定性強，更有利于自動化和規模化分析。隨著人類基因組計劃和國際HapMap計劃的相繼完成，為包括T2DM在內的復雜疾病易感基因的發現提供了新的更有效的手段和技術。全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）是其主要代表。GWAS僅用簡單的頻率檢驗便可發現與特定復雜疾病相關聯的遺傳變異[4]。通過GWAS研究，已在歐洲人群中發現多個易感基因和易感位點與T2DM具有顯著關聯性[5,6]，主要的易感基因有TCF7L2、FTO、CDKAL1、IGF2BP2、SLC30A8等。但中國人群與歐洲人群具有不同的遺傳背景、生活習慣及文化習俗，在糖尿病的病因發病機制方面與歐洲人群存在差異。雖然也有應用日本人群的GWAS研究，然而中國成人Ⅱ型糖尿病的胰島功能特點不僅不同于歐洲患者，和日本等亞洲患者也不盡相同[7]。因此，在中國人群中進行易感基因多態性位點與T2DM發病風險關系的探索，不僅有助于揭示糖尿病的致病機制，也為制定區域化的防治策略和個體化治療方案提供數據基礎。

FTO（fat mass and obesity associated）基因又稱為肥胖基因，位于第16 條染色體（16q12.2），含有9個外顯子，基因長度為410.50 kb，廣泛表達于人體組織的各發育階段，且在下丘腦、骨骼肌及脂肪等組織中高度表達[8]。根據GWAS文獻報道，FTO基因多態性在芬蘭和英國人群中與T2DM有顯著關聯[9,10]，而在國內對FTO基因與T2DM患病風險的相關性研究較少。本文選取了FTO基因rs8050136 SNP位點，利用Sequenom MassArray?iPLEX系統，對238例糖尿病患者及239例健康對照者進行基因分型，旨在通過病例對照研究，在中國人群中探討FTO基因單核苷酸多態性與Ⅱ型糖尿病發病風險的相關性，為T2DM提供數據支持和奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

確診T2DM患者血液樣本238例，平均年齡為58.27歲。同期該地區體檢健康者血液樣本239例，無糖尿病相關病史，無其他代謝性疾病病史，平均年齡為56.12歲。樣本為外周靜脈血200 μL，置于-20℃保存。DNA提取試劑盒購自OMEGA公司，基因分型試劑盒購自美國Sequenom公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

用DNA提取試劑盒（OMEGA Bio-TeK，E.Z.N.A. Blood DNA Kit）提取DNA，步驟參照說明書，提取的DNA保存于-70℃備用。

1.2.2 引物的設計

針對FTO基因SNP位點rs8050136，利用Sequenom MassArray?Assay Design 3.1軟件設計PCR擴增及延伸引物。其中特異性擴增引物序列為5'-ACG TTGGATGAAGGCAAAAACCACAGGCTC-3'和5'-AC GTTGGATGTGACAGTGCCAGCTTCATAG -3'，單堿基延伸引物為5'-GGGCAACCACAGGCTCAGATATT -3'。

1.2.3 基因分型

利用Sequenom MassArray質譜陣列技術（美國，Sequenom公司）對FTO基因rs8050136位點進行基因分型。方法如下：①多重PCR反應擴增DNA樣本；②蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）反應，去除未反應完的dNTP；③單堿基延伸反應（single base extension, SBE）在SNP位點處延伸單個堿基；④將所得反應產物用樹脂脫鹽后經自動點樣儀點樣于SpectroCHIP芯片上；⑤將點制后的芯片用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）檢測，根據單堿基延伸的等位基因的分子質量差異進行基因分型。

1.2.4 數據分析

分別統計病例組和對照組基因型分布頻率，經Hardy-Weinberg平衡檢驗后，用SPSS13.0軟件進行分析，應用χ2檢驗分析病例組和對照組基因型的分布差異，計算其相應的OR值及P值，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 rs8050136多態性與T2DM易感性的關系

rs8050136位點在病例組和對照組中有CC、CA和AA三種多態性（圖1）。rs8050136位點的基因型分布及統計結果見表1。CC、CA和AA三種基因型在病例組的分布頻率分別為70.6%（n=168）、26.9%（n=64）和2.5%（n=6），而在對照組分布頻率分別為82.0%（n=196）、18.0%（n=43）和0.0%（n=0）；等位位點A和C的分布頻率在病例組分別為0.16和0.84，而在對照組的分布頻率分別為0.09和0.91。統計結果顯示2組間基因型頻率分布差異在顯性模型和超顯性模型中有顯著性（χ2= 8.603，P= 0.003；χ2= 5.428，P= 0.02）。在顯性模型中，相對CC基因型而言，CA-AA基因型均可能增加Ⅱ型糖尿病發生的危險性（OR =1.915, 95% CI: 1.241～2.954, P =0.003）；在超顯性模型中，相對CC-AA基因型而言，CA基因型可能增加T2DM發生的危險性（OR =1.689, 95% CI: 1.090～2.615, P =0.019）。而2組間等位基因頻數分布有顯著性差異（χ2=10.614, P=0.001）。

3 討論

圖1 FTO基因rs8050136多態位點CC、CA和AA基因型的特征質譜圖Figure 1 Schematic of the CC, CA and AA polymorphism of rs8050136 in FTO

表1 rs8050136 SNP位點多態性及其與T2DM風險的關系Table 1 The relationship between SNP of rs8050136 and susceptibility of T2DM

FTO基因編碼一種酮戊二酸（2-oxoglutarate, 2OG）依賴的核酸去甲基化酶。Fawcett和Barroso[11]認為FTO所具有的這種去甲基化作用可能調節了某些代謝相關基因，而這些作用的失調可能與T2DM有關，但其確切的分子機制尚不清楚。較早調查發現FTO多態性與其他眾多肥胖并發癥存在關聯，在眾多并發癥中，FTO多態性與T2DM的關系最引人關注。Frayling[12]等發現FTO多態性可以通過作用身體質量指數（Body Mass Index，BMI）使T2DM風險增加，一旦調整BMI后FTO多態性與T2DM即失去關聯，提示T2DM可能僅僅因為是肥胖并發癥而與FTO多態性相關聯的。相反，Yajnik等[13]在對印度人群的研究中發現，SNP位點rs9939609風險等位位點A與T2DM有很強的獨立相關性，即使在對BMI進行校正后FTO多態性與T2DM的關聯仍顯著。

本研究采用病例-對照的研究，選取FTO基因上的SNP位點rs8050136，通過對238例T2DM患者和239例健康對照者進行基因分型，發現位點rs8050136與T2DM的發病風險顯著相關。對rs8050136位點來說，相對于基因型CC而言，CA雜合型和CA-AA基因型均能顯著性增加患病的危險性，而其等位基因在病例組和對照組間的頻數分布也有顯著性差異。該結果與Scott等[9]的GWAS研究結果相似。此外，根據Han等[14]的研究顯示，rs8050136位點的多態性與BMI有顯著的關聯，在rs8050136位點上帶有1個或2個等位位點A的個體，比不帶有等位位點A的個體有更高的BMI。同時，Hotta等[15]的研究也顯示，在日本人群中rs8050136位點的多態性能顯著性增加個體患代謝綜合征的風險，提示rs8050136的多態性可能通過改變機體整體代謝能力，從而影響糖的代謝作用，引起T2DM。而根據Jowett等[16]的研究，rs8050136位點的多態性與T2DM患病風險有直接的關聯，但rs8050136位點的多態性本身并不影響FTO基因的有效表達，而是與距離FTO基因270 000個堿基對的RBL2（retinoblastoma-like protein 2）的表達有直接的關聯。GWAS研究發現RBL2與T2DM的發病有著密切的關系[17]，但其具體機制仍不清楚。Stratigopoulos等[18]研究發現CUTL1影響FTO基因的表達，而FTO基因rs8050136位點剛好位于CUTL1調控蛋白的結合位點上。rs8050136位點的單核苷酸多態性則會直接影響CUTL1與FTO基因的結合效率，從而影響FTO基因的表達而間接改變機體的整體代謝能力，其中等位位點A比等位位點C在CUTL1與FTO基因的結合效率更強。

綜上所述，通過對中國人群238例T2DM患者和239例健康對照者FTO基因SNP位點rs8050136的基因分型及統計分析，發現在中國人群中FTO基因多態性位點rs8050136與T2DM的發病風險相關。其中rs8050136位點CA基因型和CA-AA基因型可顯著增加T2DM的發病風險。

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The association study between single nucleotide polymorphisms of FTO and susceptibility of T2DM

HU Jiale1, HUANG Wanxian1, GAO Yang1, ZHU Anna1,2, SUN Minying1,2, YANG Xuexi1★
(1. Institute of Antibody Engineering, School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China；2. DAAN Gene Co., Ltd. of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510665, China)

Objective To evaluate the association between single nucleotide polymorphism (SNP) ofFTO(fat mass and obesity associated) and susceptibility of Type Ⅱ Diabetes Mellitus (T2DM). Methods

The single nucleotide polymorphism rs8050136 ofFTOwas detected via Sequenom MassArray?iPLEX System in 238 T2DM patients and 239 healthy controls for the frequencies of their alleles and genotypes. Data were analyzed via Chi-square test and Logistic regression analysis by codominant, dominant, overdominant, and recessive model. Results The frequencies of genotypes of rs8050136 in both dominant and overdominant model shown significant difference in the distribution between T2DM patients and healthy controls (χ2= 8.603,P= 0.003; χ2= 5.428,P= 0.02). The odds ration (OR) of CA and AA-CA were 1.751 (95%CI: 1.129～2.717,P=0.012), and 1.915 (95%CI: 1.241～2.954,P=0.003), shown significantly increased the risk of developing T2DM in comparison with CC genotype. The frequencies of alleles (C and A) of rs8050136 shown significantly difference (χ2= 10.614,P= 0.001). TheORof A was 1.933 (95%CI: 1.298～2.880,P=0.001), shown that the A allele maybe the risk allele of T2DM in comparison with C allele. Conclusions The CA and CA-AA genotypes of rs8050136 inF

TOwere associated with increased the risk of T2DM in Chinese population, and the A allele of rs8050136 were the risk allele of T2DM.

FTO; Single nucleotide polymorphism; T2DM；Susceptibility

廣州市科技攻關計劃（2008A1-E4151）

1. 南方醫科大學生物技術學院抗體工程研究所，廣東，廣州 510515 2. 中山大學達安基因股份有限公司，廣東，廣州 510665

★通訊作者：楊學習，E-mail: yxxzb@sohu.com