紅芪膠囊的質量標準研究＊

徐勝龍 王 晉 李 靜 郭國禎 李予蓉 第四軍醫大學軍事預防醫學院放射醫學教研室（西安710032）

紅芪膠囊是第四軍醫大學放射醫學教研室新研制的純中藥制劑，由紅景天、黃芪、沙棘、刺五加浸膏4味中藥組方而成。屬于創新中藥6.1類，其功能生津養血，補腎健脾；主治各類放射損傷，增強放射治療療效和減輕放療毒副反應。本實驗系首次將以上四味藥配伍制備膠囊劑用于主治放射損傷等的新藥研究，并獲得國家專利（ZL200910021359.6）。

方中黃芪、刺五加浸膏為臣藥，沙棘為佐藥，共同輔佐紅景天的活血化淤消腫、解熱退燒、滋補元氣等功效。藥效學研究結果表明［1］［2］，紅芪膠囊可提高機體氧化和還原反應的比值，清除體內過剩的自由基，具有降低脂質過氧化物生成的作用和抗氧化酶活性的能力，從而減輕對生物細胞膜組織的損傷。并能抑制脂質過氧化鏈式反應中產生的脂質自由基的傳遞，且有明顯的藥物劑量依賴性。實驗證實紅芪膠囊具有高效低毒、多靶點和作用持久等功能特點。為了對該膠囊進行質量控制，穩定性考查以及保證臨床用藥安全，本實驗通過對紅芪膠囊中紅景天及黃芪的有效成分用薄層色譜法進行定性鑒別；針對紅景天采用高效液相色譜法測定膠囊中紅景天苷的含量，進行定量分析；依據藥典附錄要求，對膠囊的崩解時限、微生物限度、重金屬、砷鹽限量等進行考察。以期為該膠囊劑可靠、準確、靈敏度高的質量控制標準提供了實驗依據。

1 試藥與儀器 1.1儀器 美國Waters高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），2695分離單元，2996檢測器，Empower色譜工作站，配自動進樣器；色譜柱（UltimateTM C18柱，4.6×250mm，5μm，Welch Materials，Inc.）；R200D 電子分析天平（德國Satorius公司）；電子天平，MP 2002，上海恒平科學儀器有限公司；超聲波清洗器，SK 250LHC，上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 紅芪膠囊（第四軍醫大學軍事預防醫學院提供，批號：20091205，20091215，20091225。該膠囊已申請中國發明專利，專利號200910021359.6已公示）。紅景天苷（C14H20O7），批號110752—200511，購自中國藥品生物制品檢驗所；甲醇（CH3OH），AR級，西安化學試劑廠；甲醇（CH3OH），HPLC 級，美國Heneywell公司；超純水（H2O），美國Millipore純水器制備）；硅膠G 板（青島海洋化工廠）：CS 9000型薄層掃描儀（日本島津）：自動噴霧顯色器：定量點樣毛細管（Drummond，USA）。

2 方法與結果 2.1 紅芪膠囊的制備 將紅景天進行除雜處理后，粉碎，采用70%乙醇回流提取，加醇量為8倍量，回流兩次，每次回流2h，合并濾液，濃縮，減壓干燥。黃芪和沙棘混合加8倍量水煎煮兩遍，每次1.5h，過濾，合并濾液，濃縮，減壓干燥，所得干膏與刺五加浸膏及上述紅景天干膏，粉碎，加入適量的輔料，混合均勻，95%乙醇制粒，60℃以下烘干，過20目篩，裝入0號膠囊，即得。

2.2 紅芪膠囊的性狀［2］本品為膠囊劑，3批樣品觀察，除去膠囊殼后顯淺棕色至棕褐色；氣微香、味微苦。

2.3 理化顯色法鑒別紅芪膠囊［2］取本品內容物2g，加乙醇20mL 使溶解，濾過。取濾液1mL，加3%碳酸鈉溶液1mL 與新配制的重氮對硝基苯胺試液1～2滴，即顯紅色；另取濾液1mL，加5%亞硝酸鈉溶液3～5滴與10%硝酸鋁溶液3～5滴，稍放置，加氫氧化鈉試液2mL，即顯紅棕色。

2.4 薄層色譜法定性鑒別 2.4.1紅景天的薄層色譜法鑒別：取本品內容物約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品備用。精密稱取紅景天苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB）試驗，吸取對照品溶液及供試品溶液各10μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－丙酮－水（6∶3∶1∶1）的下層溶液為展開劑［3］，展開，展距18cm，取出，晾干，置碘蒸氣中熏2～3min。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點（見圖1）。

圖1 紅芪膠囊中紅景天的薄層色譜圖

2.4.2 黃芪的薄層色譜鑒別：取本品內容物2g，加甲醇20mL，加熱回流1h，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱（100～120目，5g，內徑10～15mm）上，用40%甲醇100mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水30mL使溶解，用水飽和的正丁醇提取2 次，每次20mL，合并正丁醇液；用水洗滌2 次，每次20mL；棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5mL 使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點，紫外光燈（365nm）下顯相同的橙黃色熒光斑點。見圖2。

圖2 紅芪膠囊中黃芪甲苷紫外薄層色譜圖

2.5 紅景天苷的含量測定［2，4］2.5.1色譜條件與系統適用性試驗：色譜柱（UltimateTMC18柱，4.6×250mm，5μm）：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇－水（15︰85）；檢測波長：275nm；流速：1.0mL／min；進樣量：10μL。在上述色譜條件下紅景天苷峰理論板數計算不低于2000。

2.5.2 對照品溶液的制備：精密稱取紅景天苷對照品25.00mg，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為對照品母液。

2.5.3 供試品溶液與空白溶液的制備：取本品內容物約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取過濾液，即得；依法制備空白溶液。

2.5.4 線性關系考察：分別精密量取對照平母液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5mL，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，進樣。以紅景天苷的峰面積（y）對紅景天苷的濃度（x）做線性回歸，得方程為y＝3138368x ＋10054，相關系數R2＝0.9987，說明紅景天苷的峰面積在0.10～1.50mg／mL 濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5.5 精密度試驗：取濃度為0.25mg／mL 的對照品溶液重復進樣6次，測定峰面積積分值。紅景天苷的峰面積的相對標準差（Relative Standard Devia－tion，RSD）值為0.39%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗：精密吸取濃度為0.25mg／mL 的對照品溶液及供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h進樣測定，結果顯示各時段峰面積平均值分別為779466.2、1952541紅景天苷的峰面積的RSD值分別為0.24%、0.17%，結果表明紅景天苷峰值在12h內穩定。

2.5.7 重現性試驗：分別制備6份供試品，在上述色譜條件下測定，測定峰面積，紅景天苷的峰面積的RSD 值為0.58%。

2.5.8 加樣回收率試驗：精密稱取已測定供試品溶液（批號091215，0.16%）5份，分別添加一定量的紅景天，按供試品溶液制備項下操作，在上述色譜條件進行測定，計算回收率，平均回收率為98.47%，RSD 值為0.71%。結果表明紅景天苷回收率良好。結果見表1。

表1 供試品中紅景天苷加樣回收率測定結果

2.5.9樣品測定：分別從3批紅芪膠囊中取樣，每個批次精密稱定膠囊內容物約，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得上樣溶液。在上述色譜條件下進樣測定。色譜圖見圖3。

每粒膠囊含紅景天苷限度確定：三批樣品平均含量為0.16%。依據日處方量，經小試、中試確定了千粒處方。據千粒處方得紅芪膠囊主藥紅景天中紅景天苷含量：400×0.16%× （1±10%）＝0.576～0.704（mg／粒），考慮到產品批量生產及穩定性諸因素的變化，擬規定紅芪膠囊每粒含紅景天苷計，不得少于0.50mg／粒。結果見表2。

表2 3批紅芪膠囊樣品測定結果

2.6 崩解時限檢查 依據《中國藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下有關規定，照崩解時限檢查法（附錄ⅫA）檢查。對本實驗的3批紅芪膠囊樣品進行了檢查，結果平均崩解時限為36.3min，符合標準規定。

2.7 微生物限度 依據《中國藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下有關規定，照微生物限度檢查法（附錄ⅩⅢC）檢查。對本實驗的3批紅芪膠囊樣品進行了檢查，結果顯示細菌含量平均為52個／g，霉菌含量平均＜10個／g，未檢測出含有大腸桿菌。

圖3 紅芪膠囊中黃芪甲苷和紅景天苷的HPLC色譜圖

2.8 重金屬、砷鹽限量檢查 《中國藥典2010年版一部》附錄ⅠL 膠囊劑下雖未有關于重金屬、砷鹽限量檢查項，鑒于中藥新藥的質量標準要求，按《中國藥典2010年版一部》重金屬檢查法（附錄ⅨE）和砷鹽檢查法（附錄ⅨF）對紅芪膠囊樣品進行檢查。

2.8.1 重金屬檢查：重金屬檢查結果分析顯示：3批紅芪膠囊內容物重金屬含量未超過百萬分之十標準比色管，可見本品含量不超過百萬分之十，根據中藥新藥對重金屬的限度要求，在允許的范圍之內。

2.8.2 砷鹽限量檢查：砷鹽限量檢查結果分析顯示：3批樣品內容物砷鹽含量均未超過百萬分之二，根據中藥新藥砷鹽的限度要求，本品的砷鹽含量測定結果不作為質量控制指標。

圖4 3批紅芪膠囊樣品中砷鹽檢查結果

3 討 論 隨著地球環境污染的惡化，天然植物藥物的生存受到一定程度的威脅，而本品所用藥材的原產地、藥材粗加工中不可避免地會攝入自然條件下的（如空氣、水源、土壤）及后續工藝流程中對人體健康的有害成分。那么藥材安全已經成為市場準入的關鍵，針對中藥材及中藥制劑進行重金屬、砷鹽的測定評價藥品安全性具有十分重要的意義。

為了尋找療效佳、毒性低、便于臨床使用治療放射損傷疾病的藥物，我教研室根據中藥理論、中藥屬性及在“君臣佐使”的組方原則下，根據中醫辨證施治的理論，研制出一種治療放射損傷疾病的輻射防護中藥紅芪膠囊。根據國家中藥新藥的質量標準要求，本品內容物重金屬、砷鹽限量檢查，均符合國家藥典規定之標準。藥品安全是國家藥典的強制性檢測指標，實驗室檢查證明藥材的原材料購置及后續加工藝流程等環節安全可靠。對該藥進行了薄層色譜等是對藥物成分進行鑒別，甄別藥物有效成分是對藥物基本藥效的認證。所以對紅芪膠囊中紅景天及黃芪的薄層色譜進行了鑒別，結果為：薄層色譜斑點清晰，分離效果良好，確保了藥效多靶點作用的特性。經過高效液相色譜及HPLC色譜條件測定，紅景天膠囊保留時間適合，能與其它有效成分進行較好地分離。用上述HPLC 色譜條件測定紅景天膠囊含量，在0.10～1.50mg／mL 濃度范圍內線性關系良好，加樣回收率高，可作為紅芪膠囊中質量控制標準。

通過對本品各項指標的考察，確定的定性、定量方法，經過多批樣品進行反復測定，為紅芪膠囊進入臨床試藥前提供質控標準依據。本實驗所建立的方法可靠，準確性好，符合國家藥典及藥品臨床準入之規定，可用于該膠囊的質量控制。

［1］ 李予蓉，譚 娟，王 晉，等.紅芪膠囊對60Co－γ射線輻射后大鼠腦、肺、血清SOD 活性和MDA 含量的影響［J］.陜西中醫，2010，（31）：363－364.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1.

［3］ 徐曉瑩，李寶明，何麗一，等.紅景天中紅景甙的薄層光密度測定法研究［J］.藥物分析雜志，1996，16（4）：272.

［4］ 吳少雄，柳陳堅，郭亞東，等.HPLC法測定復方紅景天膠囊中紅景天苷的含量［J］.云南中醫中藥雜志，2008，29（6）：52－53.