商陸皂苷甲對腎小球系膜細胞增殖的影響＊

張祥貴 湯杰印 遵義醫學院第五附屬（珠海）醫院腎內科（珠海519100）

商陸皂苷甲（esculentoside A，EsA）是從中草藥商陸塊根中提純的一種三萜皂苷類化合物，已被證實有顯著調節免疫、抗炎、抑制細胞增殖和促凋亡的作用［1，2，3，4，5］，在自身免疫性腎炎動物模型中顯示良好的治療效果［6，7］，本課題通過EsA 對BXSB小鼠的治療觀察發現，EsA 可顯著抑制狼瘡模型小鼠血清IL－6，TNF－a的表達，明顯改善蛋白尿及腎臟的炎癥［8］，EsA還抑制了腎臟組織Bcl－2，PCNA 的表達，并誘導Fas，FasL，Caspase－3的表達，使腎小球內有核細胞數及系膜區面積測定明顯減少，抑制了腎組織的增殖，促進了腎固有細胞的凋亡，明顯改善了腎臟的病理狀況［9，10］。本實驗選用大鼠腎小球系膜細胞（rat glomerular mesangial cell，rGMC）為對象，觀察EsA對體外培養的rGMC 增殖和毒性的影響，旨在為明確EsA 治療狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）等系膜增殖性腎炎腎組織的作用靶點，并探討其作用機制。

1 材料與方法 1.1 材料 大鼠腎小球系膜細胞株（HBZY－1）購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）；商陸皂苷甲購自上海同田公司，批號：10072431，白色粉劑（不溶于水），于實驗前溶于0.1%DMSO 溶液中，MTT、DMSO、胰酶（含0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 和酚紅）購自Sigma公司，MEM培養液購自Genom 公司，優級胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青公司，酶標儀（ELX800）為Bio－Tek Instruments INK（美國）公司。

1.2 方 法 1.2.1 rGMC 培養：rGM 購回后于倒置顯微鏡下見細胞呈梭形生長，鋪滿瓶底，培養液透明清亮，適應性培養4h后吸取全部培養液（5%FBS的MEM 培養液）入無菌瓶內，并將FBS濃度由5%調整為10%做GMC 培養備用。用PBS液洗細胞2次，加入胰酶消化細胞，見細胞變圓，呈片狀脫落時，加入10%FCS的MEM 培養液，終止消化，將細胞懸液移入離心管中，800 轉，4min 離心后，棄去上清液，加入3mL10%FCS的MEM 培養液重懸細胞，按1：3接種于25mm2培養瓶，每瓶加入10%FBS的MEM 培養液至5mL，吹打均勻，放入37°C，5%CO2培養箱中培養，2d換1 次液，細胞生長迅速，3d傳1次代。本實驗均采用6～9代rGMC。

1.2.2 MTT 法測定DMSO 對rGMC 增殖影響：由于EsA 不溶于水，DMSO 是“萬能溶劑”，且通常將10%DMSO 用于細胞凍存，但不同濃度的DMSO 對不同細胞的增殖有不同的影響，本實驗欲用DMSO 溶解EsA，故需先選擇合適濃度的DMSO，使其對rGMC增殖無影響又能充分溶解EsA。

取對數生長期rGMC，用胰酶消化，離心收集細胞棄上清，用10%FBS的MEM 培養液將細胞濃度調制1×104／mL，每孔200ul接種于96孔板，37°C，5%CO2培養箱中孵育24h后，換用無血清的MEM 培養液培養rGMC24h，使細胞同步化生長于G0期。對照組加入10%FBS的MEM 培養液，實驗組除加入上述培養液外，還分別加入終濃度為1.2%、1.0%、0.8%、0.5%、0.1%的DMSO，上述各組分別培養至24h，48h及72h，換新鮮培養液，每孔加入0.5%MTT 20uL，繼續培養4h后，吸棄上清，每孔加入150uLDMSO，振蕩l0min，使結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀490nm 波長處測定各孔吸光值（OD 值）。實驗重復4次。

1.2.3 MTT 法測定EsA 對rGMC 增殖的影響：按上述培養方法，rGMC同步化生長于G0期后，對照組加入10%FBS的MEM 培養液，實驗組除加入上述培養液外，還分別加入終濃度為20mg／L、10mg／L、5mg／L、2.5mg／L、1.25mg／L、0.625mg／L用DMSO 溶解的EsA，上述各組分別培養至24h，48h及72h時，換新鮮培養液，按上述方法加入MTT 培養4h后，加入DMSO 振蕩l0min 溶解結晶物，在酶聯免疫檢測儀490nm 波長處測定各孔OD 值。實驗重復4次。

1.2.4 MTT 法測定EsA 對rGMC 毒性影響［11］：方法同上，只是在無血清同步后行藥物干預時，各組均改為無血清的MEM 培養液。

1.2.5 統計學方法：使用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料用s表示，多組間資料間均數比較采用方差分析，P＜0.05為統計學有顯著性差異；多個樣本均數的兩兩比較，方差齊者采用LSD－t檢驗，方差不齊者用Tamhane＇sT2檢驗，P＜0.05為統計學有顯著性差異。

2 結 果 2.1 rGMC 生長形態觀察 經傳代后rGMC，24h后幾乎全部伸展貼壁，生長迅速，約2～3d鋪滿瓶底。在倒置顯微鏡下觀察，rGMC 呈梭形、不規則形、紡錘形、胞核居細胞中央呈卵圓狀，胞體多突起，生長密集時，細胞接觸間隙可消失（見圖1）。

圖1 a：正常培養的腎小球系膜細胞形態（×40倍） 圖1b：正常培養的腎小球系膜細胞形態（×200倍）Fig.1a：The form of normal cultured GMC（40×） Fig.1b：The form of normal cultured GMC（200×）

2.2 DMSO 對rGMC 增殖的影響 與對照組比較，0.1%DMSO 對rGMC在24h、48h、72h的細胞增殖無明顯抑制作用，差異無統計學意義（P＞0.05），其余各組對rGMC的細胞增殖在24h、48h、72h的3個時間點或者某1～2個時間點有明顯的影響，差異有統計學意義（P＜0.05），故宜用0.1%DMSO 溶解EsA。見表1。

表1DMSO 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

表1DMSO 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

注：△與對照組比較，P＜0.05，▲與對照組比較，P＜0.01.

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）Control 6 0.541±0.022 0.821±0.069 1.657±0.260 DMSO（1.2%）6 0.437±0.054 1.257±0.088▲0.913±0.067▲DMSO（1.0%）6 0.637±0.063 1.145±0.203▲0.878±0.189▲DMSO（0.8%）6 0.589±0.164 1.020±0.191△1.119±0.092▲DMSO（0.5%）6 0.530±0.104 1.231±0.101▲1.468±0.106 DMSO（0.1%）6 0.530±0.065 0.927±0.080 1.738±0.177

2.3 EsA 對rGMC 的毒性影響 與對照組比較，濃度在0.625～20mg／L間，EsA 對rGMC 活力無明顯抑制作用，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2

表2 EsA 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

表2 EsA 對rGMC毒性作用的OD 值（±s）

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）Control 6 0.281±0.057 0.226±0.091 0.208±0.018 EsA（20mg／L）6 0.256±0.015 0.233±0.486 0.200±0.103 EsA（10mg／L）6 0.263±0.105 0.194±0.343 0.197±0.025 EsA（5mg／L）6 0.225±0.040 0.234±0.044 0.181±0.056 EsA（2.5mg／L）6 0.240±0.059 0.212±0.028 0.210±0.051 EsA（1.25mg／L）6 0.292±0.128 0.198±0.456 0.165±0.035 EsA（0.625mg／L）6 0.216±0.039 0.192±0.191 0.184±0.028

2.4 EsA 對rGMC的增殖影響 與對照組比較，EsA（2. 5－5mg／L）在48h，72h，明顯抑制了細胞的增殖（P＜0.05 或P＜0.01），見表3。

表3EsA 對rGMC增殖作用的OD 值（±s）

表3EsA 對rGMC增殖作用的OD 值（±s）

注：△與對照組比較，P＜0.01，▲與對照組比較P＜0.05

Group n OD（24h）OD（48h）OD（72h）對照組6 0.529±0.081 0.808±0.021 1.331±0.219 EsA（20mg／L）6 0.547±0.362 0.863±0.903 1.218±0.165 EsA（10mg／L）6 0.547±0.097 0.880±0.080 1.330±0.146 EsA（5mg／L）6 0.508±0.018 0.642±0.060△0.966±0.325△EsA（2.5mg／L）6 0.478±0.043 0.716±0.081▲1.032±0.123▲EsA（1.25mg／L）6 0.479±0.026 0.815±0.056 1.271±0.185 EsA（0.625mg／L）6 0.473±0.053 0.805±0.041 1.232±0.218

討 論 系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematiosus，SLE）是一種累及多系統自身免疫性疾病。SLE 常累及腎臟引起LN，其病理表現主要是GMC 大量增殖［12］。GMC 是腎小球固有細胞之一，正常情況下，幾乎不增殖，炎癥狀態下，被活化后，可見異常增殖，引起細胞外基質增加，降解減少，并釋放各種生物活性物質，這些生物活性物質可趨化單核細胞及淋巴細胞，使其釋放炎癥介質，又進一步活化了GMC，形成惡性循環，最終導致腎小球硬化，及終末期腎臟病（end－stage renal disease，ESRD）。由于GMC 增殖是多種腎小球疾病的共同病理表現，抑制GMC增殖對延緩腎小球疾病發生，發展有重要的臨床意義，并已成為研究的熱點。由于GMC 是各種致病因子作用的主要靶細胞，體外培養GMC 已成為研究腎臟病理生理的主要方法之一。

EsA 既往研究顯示其具有顯著的抑制血清中炎性細胞因子（如IL－1、TNFα、IL－6、PAF及活性氮等）的產生及調節免疫系統的作用，具有抑制人角質形成細胞增殖，而改善了銀屑病病情等作用［5］，用EsA 治療大鼠Heymann腎炎可以顯著減少尿蛋白的產生，免疫熒光和電鏡檢查發現EsA 能明顯改善大鼠腎炎的病理狀況，并有學者在臨床上用原藥商陸治療難治性LN 和原發性腎病綜合征也收到良好的效果，同時我們實驗組通過體內使用EsA 治療BXSB 小鼠后，也收到了明顯的療效，狼瘡腎炎模型小鼠腎組織和血清中炎癥細胞因子的表達和腎組織增殖明顯受到抑制，顯示了EsA 具有抗炎、抑制細胞增殖和促凋亡的作用。MTT 實驗是檢測細胞增殖的可靠且最常用的方法。本實驗結果顯示EsA（2.5～5mg／L）對血清誘導的rGMC增殖48～72h有顯著的抑制作用，表明了GMC 是EsA治療系膜增殖性腎炎的重要靶細胞，提示EsA 可通過抑制細胞增殖的方式干預系膜增殖性腎炎的病理進程，從而延緩腎小球硬化和腎臟纖維化，在腎臟疾病的治療中可能具有一定的應用價值。細胞毒性實驗結果提示實驗研究濃度范圍內EsA 對rGMC活力沒有明顯影響，抑制細胞增殖不是通過細胞毒作用促使細胞壞死實現的。

［1］ Xiao Z Y，Zheng Q Y，Zhang J P，et al.Effect of esculentoside A on Autoinmmunity in mice and its possible mechanisms［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（7）：638－644.

［2］ Xiao Z Y，Zheng Q Y.Effect of esculentoside A on production of interleukin－1、2and prostaglandin E2［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（6）：817－821.

［3］ Zhenlin Hu，Lei Qiu，Zhenyu Xiao，et al.Effects of esculentoside A on autoimmune Syndrome induced by Campylobacter jejuni in mice and its modulation on T－lymphocyte proliferation and apoptosis［J］.International Immunopharmacology，2010，10（1）：65－71.

［4］ 肖振宇，鄭欽岳，張俊.商陸皂苷甲對小鼠胸腺細胞凋亡的影響［J］.第二軍醫大學學報，2002，23（6）：659－661.

［5］ 鄧 俐，張德堂，杜 江.商陸皂苷甲對體外培養的人角質形成細胞增殖的影響［J］.中國皮膚性病學雜志，2006，20（11）：655－657.

［6］ 張 亮，張克非，吳雄飛.商陸皂苷甲對大鼠抗Thy1系膜增殖性腎炎的治療作用［J］.中國中西醫腎病結合雜志，2008，9（6）：506－508.

［7］ 肖振宇，鄭欽岳，張俊平，等.商陸皂苷甲對自身免疫綜合征模型小鼠的療效［J］.第二軍醫大學學報，2003，24（10）：1108－1111.

［8］ 馬華林，張欣洲，張祥貴.商陸皂苷甲治療BXSB狼瘡性腎炎小鼠的實驗研究［J］.廣東醫學，2011，32（12）：1540－1542.

［9］ 楊 丹.商陸皂苷甲對BXSB 小鼠腎臟細胞凋亡及Bax和Bcl－2表達的影響［D］.遵義：遵義醫學院，2010：1.

［10］ 孟令國.商陸皂苷甲對BXSB 小鼠腎組織PCNA、Caspase－3、Fas和FasL 表達的影響［D］.遵義：遵義醫學院，2011：1.

［11］ 祝正明，孫建實，趙 湘.三七總皂苷對大鼠腎小球系膜細胞增殖及細胞凋亡的影響［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2007，8（8）：471－472.

［12］ 陳灝珠，林果為，主編.實用內科學［M］.第13版.北京：人民衛生出版社，2009：2286－2293.