凝集素組織化學技術在針刺干預腦梗塞后微血管形態學研究中的應用＊

石 磊 杜元灝 黎 波 天津中醫藥大學第一附屬醫院（天津300193）

親合組織化學是利用兩種物質之間的高度親合力而建立的一種方法，它不同于免疫組織化學，不屬于抗原抗體反應，又與組織化學有本質上的區別，因此，Bayer（1976）首次稱之為親合組織化學。凝集素不是來源于或參與免疫反應的產物，但它具有與特定糖基相結合的特性，因而，凝聚素可以作為一種探針來研究細胞上的糖基，特別是細胞膜的微小化合物結構，從而探索細胞的生物學結構和演變過程。這種技術一方面利用凝集素與酶、熒光素、膠體金等標記物結合，另一方面又可以與細胞膜糖基結合形成一種親合反應，因此，Ponder（1983）提出應稱為“凝集素組織化學”而不能稱為“凝集素免疫組織化學”。凝集素染色可采用直接法或間接法［1，2］，目前應用較多的則是糖－凝集素－糖法。

本研究將這一技術應用于針刺干預腦梗塞后微血管形態學變化的實驗中，并進一步根據研究要求進行方法調整，現將研究方法及部分實驗結果介紹如下。

1 方法 筆者根據Gavin Thurston等的實驗方法進行調整［3，4，5］，在腦梗塞急性期血管形態學變化及針刺干預效應研究中，以凝集素組織化學技術對急性期MCAO 大鼠腦血管形態變化進行研究，實驗步驟簡介如下：①采用Longa的腔內線栓法阻滯大鼠右側大腦中動脈，復制腦梗塞模型：選擇健康雄性Wistar大鼠（北京大學醫學部實驗動物科學部提供），體重180～200g，隨機分為模型對照組和電針干預組，普通層流架系統喂養。②處理方法：電針干預組在MCAO 后即刻針刺人中穴，用15Hz，1mA 的電刺激持續20min；模型對照組和空白對照組均同樣抓取固定，但不進行任何治療。③樣本制備：針刺治療組、模型對照組分別在MCAO 后1、3、6h，于一側股靜脈注射生物素化番茄凝集素（Vector公司，貨號：B－1175，100μg／100μL生理鹽水），2min后，開胸行心臟灌注，灌注液為1%多聚甲醛與0.5%戊二醛混合PBS緩沖液，130mmHg壓力連續灌注5min，取腦，冰凍切片，切片厚度35μm。冷丙酮固定10min，－20℃保存待檢。④染色：取冰凍切片，PBS緩沖液洗5min×2，置于PBS緩沖液（含0.3%Triton X－100）中，37℃孵育4h，滴加ABC復合物（Vector公司，貨號：PK－4000），37℃孵育1h后，PBS緩沖液洗5min×2，滴加DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI－9032）染色試劑反應15min，徹底水洗終止反應，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 研究結果

2.1 染色結果 染色結果如圖1所示。染色結果顯示，凝集素組織化學技術可以比較完整、立體的顯示腦組織微血管形態以及腦實質血管分布特征，血管經染色后邊緣清楚，與組織背景色彩對比明顯，便于計量統計和圖像的分析、處理。

2.2 結 果 采用Pro－Plus圖像分析系統進行圖像采集并導出相應數據進行統計分析，見表1。

表1 MCAO 大鼠梗死塞周圍腦血管量比較（±sR，n＝6）

表1 MCAO 大鼠梗死塞周圍腦血管量比較（±sR，n＝6）

△表示與空白對照組比較P＜0.001，▲表示與模型對照組比較P＜0.01。

時間空白對照組模型對照組電針干預組317.00±7.40梗塞1h136.20±2.96△ 195.50±5.61△▲梗塞3h130.39±9.58△192.50±10.98△▲梗塞6h130.83±7.97△ 186.28±9.82△▲

梗死塞周圍腦血管量統計結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO 后1、3、6h血管量均顯著減少，有統計學差異P＜0.001），電針干預組與相對應模型對照組各時相比較，血管量均顯著增加，有統計學差異（P＜0.01），但是仍顯著少于空白對照組（P＜0.001）。

表2 MCAO 大鼠梗塞區腦血管量比較（±sR，n＝6）

表2 MCAO 大鼠梗塞區腦血管量比較（±sR，n＝6）

△表示與空白對照組比較P＜0.05，◇表示與模型對照組比較P＜0.05

時間空白對照組模型對照組電針干預組152.40±2.50梗塞1h115.80±3.67△ 132.50±5.52△◇梗塞3h116.24±4.28△ 132.40±4.28△◇梗塞6h116.33±3.11△ 129.93±5.98△◇

梗死塞腦血管量統計結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO 后1、3、6h血管量均顯著減少，有統計學差異（P＜0.05），電針干預組與模型對照組比較，各時相腦血管數均增加，有統計學差異（P＜0.05），但是，與空白對照組比較仍顯著減少，有統計學差異（P＜0.05）。

圖1 番茄凝集素對大鼠腦微血管形態研究 DAB染色

3 討 論 凝集素組織化學已經廣泛應用于生物學及醫學檢驗等相關領域，關于凝集素及其應用的研究在國外的文獻報道中多見［6，7，8，9］，但在國內鮮有報道，本研究將這一方法應用于腦梗塞急性期血管形態學變化及針刺干預效應研究中，從研究結果可見：凝集素組織化學染色可清晰、完整的顯示腦微血管形態，圖像對比度明顯，便于圖像分析、數據提取并更好地保證了分析結果的可靠性。

本研究統計結果顯示：電針干預可增加MCAO 模型大鼠梗死區及周圍有血流灌注的腦血管量，提示電針干預能夠更好的促進腦梗塞急性期側支循環建立，從而增加腦血流灌注。

［1］ 沈關心，周汝麟.現代免疫學實驗技術［M］.第2版.武漢：湖北科學技術出版社，2002：220－223.

［2］ 王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學技術［M］.北京：人民衛生出版社，2000：418－437.

［3］ GAVIN THURSTON，PETER BALUK，AKIRA HIRATA，etc.Permeability－related changes revealed at endothelial cell borders in inflamed venules by lectin binding［J］.American Journal of Physiology.1996Dec，271（6Pt 2）：H2547－62.

［4］ Gavin Thurston，Thomas J.Murphy，Peter Baluk，etc.Angiogenesis in mice with Chronic Airway Inflammation.American Journal of Pathology［J］.Vol 153，No.4.October 1998：1099－1112.

［5］ Taichi Ezaki，Peter Baluk，Gavin Thurston，etc.Time Course of Endothelial Cell Proliferation and Microvascular Remodeling in Chronic Inflammation［M］.American Journal of Pathology.Vol 158，No.6.June 2001：2043－2055.

［6］ Hiroya Hashizume，Peter Baluk，Shunichi Morikawa，etc.Openings between Defective Endothelial Cells Explain Tumor Vessel Leakiness［M］.American Journal of Pathology.Vol 156，No.4.April 2000：1363－1380.

［7］ Tetsuichiro Inai，Michael Mancuso，Hiroya Hashizume，etc.Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor（VEGF）Signaling in Cancer Causes Loss of Endothelial Fenestrations，Regression of Tumor Vessels，and Appearance of Basement Membrane Ghoses［M］.American Journal of Pathology.Vol 165，No.1.July 2004：35－52.

［8］ Bernaid Thébaud，Faruqa Ladha，Evangelos D.Michelakis，etc.Vascular Endothelial Growth Factor Gene Therapy Increases Survival，Promotes Lung Angiogenesis，and Prevents Alveolar Damage in Hyperoxia－Induced Lung Injury：Evidense That Angiogenesis Participates in Alveolarization［M］.Circulation.October 18，2005，112：2477－2486.

［9］ Michael R.Mancuso，Rachel Davis，Scott M.Norberg，etc.Rapid vascular regrowth in tumors after reversal of VEGF inhibition［M］.The Journal of Clinical Investgation.Vol116.No.10.October，2006：2610－2621.