2－脫氧葡萄糖聯合順鉑對胰腺癌細胞系的體外抑制作用

西安交通大學醫學院第一附屬醫院 （西安710061） 穆 喆 耿希剛

由于胰腺癌早期癥狀不明顯，待出現癥狀多已為中晚期，失去最佳治療機會，且胰腺位置毗鄰重要臟器，給手術和放療造成了很大的困難。至今，胰腺癌的治療效果并不令人滿意，5年生存率僅僅從20世紀70年代的3%上升至4%［1］。對胰腺癌，尤其是晚期的胰腺癌，雖然主要采用吉西他濱等化療方案，由于其毒副作用等的限制，未能有很好的綜合效果，分子靶向藥物的療效也有待進一步提高，因而胰腺癌的治療方案，仍需要進一步的探討，可能的治療思路，來自對胰腺癌細胞的高度依賴的糖酵解途徑（Wer ber g效應）［2］進行攔截。1962年，Br own［3］報道了2－脫氧葡萄糖（2－Deoxyglucose，2－DG）對腫瘤有抑制作用后，2－DG 作為抗腫瘤藥物引起了人們的關注。2－DG和葡萄糖具有相似的結構，被腫瘤細胞攝取后，能夠和細胞內的己糖激酶［4－5］結合，競爭性抑制己糖激酶的活性，阻礙糖酵解的進一步進行，干擾腫瘤細胞ATP的合成，從而阻斷腫瘤細胞的能量來源［6－7］，造成細胞內ATP剝奪，使得細胞死亡。隨著更深入的研究，人們發現2－DG對腫瘤細胞還有其他的作用機制，如對糖基化的抑制［8］，對凋亡的誘導［9］以及聯合化療藥物以及非常規化療藥等形成放化療增敏等作用［9－11］。本實驗基于2－DG對腫瘤的抑制作用以及聯合抑制作用［12］，使用2種不同種系的胰腺癌細胞系，觀察2－DG聯合廣譜抗腫瘤藥物順鉑對胰腺癌細胞系體外抑制作用以及凋亡的誘導作用。

材料與方法

1 細胞以及分組 人類胰腺癌細胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）由西安交通大學病理實驗室以及細胞生物實驗室惠贈，每組正常培養以及傳代，待穩定傳代3～4代后投入使用。

2 主要試劑 DMEM（高糖，4500 mg/L）培養基購自Sig ma公司；胎牛血清購自Gibco公司；Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自珠海健康元生物醫藥公司；順鉑凍干粉針（10 mg）購自齊魯藥業；MTT、DMSO購自Sig ma公司，caspase－3檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

3 主要儀器 離心機為西安交通大學病理實驗室器材，酶聯免疫檢測儀為交通大學病理實驗室器材，流式細胞儀為西安交通大學細胞與分子生物實驗室器材。

4 操作步驟 ①細胞培養：將人類胰腺癌細胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，放置于37℃，5%CO2中孵育，待細胞進入對數期后，使用0．25%胰蛋白酶消化后，細胞離心傳代。待細胞貼壁后，按照不同的實驗方法進行處理。②MTT實驗：取對數期生長的人類胰腺癌細胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）細胞株各分成4組：空白對照組（僅加培養基）、2－DG組（培養基中增加梯度為1 mg/L的2－DG）、順鉑組（培養基中增加1 mg/L濃度的順鉑）、二藥聯合組（培養基中增加梯度為1 mg/L濃度的順鉑以及1 mg/L的2－DG）。胰酶消化后，調整細胞濃度至3000個/ml，種植于96孔板中，每組設立6個復孔。2d更換一次培養液。24h和48h后，每孔加入200μl CCK－8后靜置4h，移至酶聯免疫檢測儀上測定各孔的細胞在490n m處的吸光值［D490］。以時間為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，繪制出細胞的生長以及抑制曲線。③凋亡和通路檢測：給藥8h后，使用Annexin V－FITC凋亡試劑盒進行細胞凋亡檢測和caspase－3活性檢測。

5 實驗數據處理與統計學分析 實驗獲取的數據以均數±標準差來表示，使用SPSS19．0進行單因素方差分析，α＝0．05。

結 果

經過24h、48h MTT測試及8h凋亡檢測得知，2－DG對2種不同種系的細胞系都有不同程度的抑制作用。而對細胞的抑制強度基本與凋亡實驗結果平行，提示2－DG對胰腺癌細胞系的抑制作用可能和對caspase－3通路介導的凋亡誘導有關。

1 MTT檢測 2－DG和順鉑聯合使用對腫瘤細胞活力的影響，和空白對照組比較，2－DG和順鉑均可降低腫瘤細胞的活力，二藥聯合對細胞活力影響更為明顯，各組結果均存在統計學差異。見圖1、2。

圖1 Panc－1細胞使用不同處理的24h和48h MTT結果

圖2 Mia細胞使用不同處理的24h和48h MTT結果

2 細胞凋亡檢測 由機制上而言，2－DG在低糖狀態下對細胞作用更明顯，本次實驗進行低糖狀態下的凋亡檢測。圖a為未處理的對照組凋亡率；圖b為單用2－DG組的凋亡率；圖c為單用順鉑組的凋亡率；圖d為二藥聯合組的凋亡率。見圖3、4。

圖3 Panc－1細胞經不同處理后8h凋亡檢測

3 caspase－3檢測 caspase－3檢測結果提示，2－DG對細胞的凋亡可能通過caspase－3活性的增強來誘導細胞的凋亡，以下為給藥8h后使用caspase－3凋亡試劑盒檢測的細胞caspase－3活性，提示2－DG對細胞的凋亡誘導可能是通過caspase－3凋亡途徑起作用的，見圖5。

圖4 Mia細胞經不同處理后8h凋亡檢測

圖5 Panc－1細胞與Mia細胞經不同處理后8h caspase－3活性檢測結果

討 論

除了經典的糖酵解抑制途徑，2－DG還可以抑制腫瘤細胞的糖基化，干擾蛋白質的組裝。未組裝的蛋白質沉積在內質網上，可以對細胞造成應激，并啟動一系列的凋亡通路來誘導細胞的凋亡［13］。

在本實驗中證實，2－DG在對2種胰腺癌的細胞系中，都有或強或弱的抑制作用。對于作用的機制，本實驗初步觀察到的，是2－DG通過誘導caspase－3通路對各種胰腺癌細胞的凋亡誘導作用，這與文獻報道一致［9］。這可能是藥物抑制胰腺癌細胞的機制之一，提示2－DG對廣譜抗腫瘤藥物順鉑可能存在協同作用。更多的機制，以及引起凋亡的進一步機制，還需要進一步的實驗來證實。

目前國際上對2－DG在體外試驗有一系列的研究，然在人體試驗上缺乏足夠的實驗數據［14］，可能的原因是口服給藥的首關消除或靜脈給藥的紅細胞毒性的考慮。隨著加速器質譜等痕量定量技術的逐漸完善，對2－DG的機制及臨床研究將有進一步的深化。

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