無呼吸機支持下小鼠主動脈弓縮窄模型優(yōu)化法評價

張煥基，黃 輝，張 坤，劉 宇，黃菲菲，王景峰

(1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內(nèi)科，廣州 510120;2.深圳市第四人民醫(yī)院心內(nèi)科 深圳 510083)

主動脈弓縮窄(Transverse aortic constriction，TAC)致左室肥厚模型是一種較為常用的研究左室肥厚病理生理過程的動物模型，其廣泛用于對動物進行心血管相關(guān)藥物、分子生物學研究。近年來，基因敲除動物技術(shù)的興起使得借助小鼠進行心血管疾病研究成為一種新的趨勢，但用小鼠建立該模型具有一定難度［1］。一方面建立該模型需要顯微外科手術(shù)，小鼠血管細小且位置較深，容易引起出血、氣胸死亡;另一方面目前國內(nèi)外現(xiàn)有的報道大部分采用氣管插管后呼吸機輔助呼吸，由于小鼠氣管纖細，氣管插管術(shù)容易造成氣道損傷死亡及呼吸機相關(guān)并發(fā)癥，增加操作難度及死亡率［2-4］。目前國外少數(shù)學者開始采用無呼吸機模型下行TAC操作，在熟悉掌握麻醉深度下手術(shù)方法較傳統(tǒng)方法更為便捷，但國內(nèi)尚未見有報道。本研究對C57BL/6小鼠建立主動脈弓縮窄壓力超負荷左室肥厚模型進行優(yōu)化，采用免氣管插管無呼吸機支持模式，對比有無呼吸機支持下的兩種手術(shù)方法的1周存活率。術(shù)后4周進行心臟超聲了解心臟形態(tài)及功能的變化，判斷模型的建立成功與否，為今后該模型的應用研究提供更為便捷的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物的選擇與分組

分別選擇SPF級成年近交系C57BL/6小鼠90只，雄性，體重20～30 g，由中山大學實驗動物中心提供【生產(chǎn)許可證號 SCXK(粵)2011-0029】。小鼠隨機分3組，為假手術(shù)組，無呼吸機手術(shù)組，呼吸機手術(shù)組，每組各30只。所有動物實驗操作程序均經(jīng)過實驗動物管理委員會批準。

1.2 主要儀器

顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司)，OLYMPUS SZ61外科雙目手術(shù)顯微鏡(上海精密光學儀器公司，日本)，小動物 ALC-V8S型呼吸機(上海奧爾科特生物科技公司)，LG-PS2鵝頸冷光源(Olympus公司，日本)，VEVO 2100超聲儀(Visual Sonics公司，加拿大)。

1.3 小鼠主動脈弓縮窄模型的建立

采用混合麻醉藥腹腔注射法。麻醉藥品為氯胺酮(8 mg/100 g)+甲苯噻嗪(1.2 mg/100 g)混合液［5］。給藥幾分鐘后小鼠全身松弛，用鑷子鉗夾指端有反應，表明已達到適宜的麻醉效果。有呼吸機組應用靜脈套管針外鞘作為氣管插管，頭端塑形稍微彎曲，插入深度約25 mm左右。氣管插管與呼吸機接頭可采用注射器頭端及軟橡膠管與“Y”形管相連制備而成。頸部用鵝頸燈光源照明，用無齒鑷將舌輕柔牽至口腔外一側(cè)，稍微上提舌部暴露聲門，聲門為一亮點，隨呼吸閉合。氣管插管時如小鼠呼吸節(jié)律發(fā)生變化則提示插管成功。接呼吸機控制呼吸(頻率100～120次/分，潮氣量0.2～0.4 mL)，可見胸廓跟隨呼吸機頻率規(guī)整運動。假手術(shù)組、無呼吸機手術(shù)組則不需要這一步驟，直接進入下一步開胸操作。開始顯微鏡無菌操作下分離胸前正中切口皮膚，右手持組織剪沿胸骨正中線自胸骨上緣劈開胸骨至第二肋間，可見胸腺位于胸骨后方視野正中，用自制拉鉤牽引胸骨形成4～6 mm寬切口。用無齒組織鑷分離胸腺暴露主動脈弓，用組織鑷夾5.0線沿氣管處主動脈上緣進入后壁及下緣穿出。預先打兩個松結(jié)，墊扎針0.5 mm直徑大小，置于第一結(jié)中，打結(jié)后抽出墊扎針［6］。縮窄后可見主動脈弓近心端搏動增強。假手術(shù)組不進行分離主動脈弓結(jié)扎操作。縫合胸部皮下肌肉組織及皮膚，術(shù)口用雙氧水消毒。

1.4 小鼠超聲評價模型

應用VEVO 2100超聲儀及24～30MHz高頻探頭于術(shù)前1天，術(shù)后4周對小鼠行經(jīng)胸超聲檢查。于胸骨旁左心室乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像，同時在該切面下獲得左室前后壁M型超聲心動圖像，記錄超過10個心動周期以上。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。文中計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料用率表示，組間比較用 Chi-Square分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TAC模型的存活率及并發(fā)癥

在實驗觀察中，發(fā)現(xiàn)主動脈弓縮窄術(shù)中及術(shù)后1周內(nèi)導致小鼠死亡主要原因為主動脈弓破裂、喉頭水腫窒息、心房及大血管損傷、胸膜破裂呼吸衰竭等。假手術(shù)組中無1例死亡。無呼吸機組中，術(shù)中內(nèi)死亡率13.3%(4/30)，術(shù)后1周無1例死亡，術(shù)后1周總存活率為86.7%(26/30)。呼吸機組中，術(shù)中死亡率為30%(9/30)，術(shù)后1周總死亡率為36.7%(11/30)，術(shù)后1周存活率為63.3%(19/30)。無呼吸機組術(shù)中死亡原因為，主動脈破裂(1只)，胸膜損傷呼吸衰竭(3只)。呼吸機組術(shù)中死亡原因為主動脈破裂(1只)、胸膜損傷呼吸衰竭(2只)、心房破裂(1只)、胸壁周圍血管損傷(1只)、氣道損傷窒息(4只)、術(shù)后1周死亡原因為氣道水腫窒息(1只)，傷口感染(1只)。無呼吸機組比呼吸機組總存活率明顯提高，兩組差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

表1 三組小鼠存活率對比Tab.1 The survival rate of mice in three groups

圖1 無呼吸機手術(shù)組對比假手術(shù)組左室前后壁明顯增厚Fig.1 Thickness of left ventricular anterior and posterior wall in TAC without ventilator group

表2 小鼠術(shù)后4周心臟彩超數(shù)據(jù)變化Tab.2 Changes of cardiac ultrasonic data after operation in sham and TAC without ventilator groups

2.2 心臟超聲對TAC模型的評價

采用心臟超聲儀對小鼠進行心臟結(jié)構(gòu)及功能的評價。無呼吸機組和呼吸機組均能使左室壁增厚，左室重量增加及心腔增大。表2數(shù)據(jù)表明無呼吸機組術(shù)后4周，小鼠的左室前壁、后壁在舒張末期及收縮末期均明顯增厚(圖1)，左室內(nèi)徑在舒張末期增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);心臟超聲儀檢測小鼠的左室重量TAC組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而左室射血分數(shù)兩組無明顯差異(P＞0.05)。

3 討論

主動脈弓縮窄致心肌肥厚模型是一種理想的模擬人類壓力超負荷誘導心肌肥厚病理生理過程的動物模型，其具有模型成功率高、可重復性好、心肌肥厚形成時間短等特點，是目前應用最廣泛的構(gòu)建心肌肥厚模型的方法。由于C57BL/6小鼠的個體體積小，耐受手術(shù)能力差，而且手術(shù)需要在顯微鏡下操作，對手術(shù)器械要求較高。另外目前采用的方法常見為呼吸機支持下操作，增加了手術(shù)難度，并且產(chǎn)生呼吸機相關(guān)并發(fā)癥，增加死亡率。因此該方法手術(shù)難度大，學習時間很長，初學者一般需要半年以上才能熟練掌握操作。

針對小鼠TAC模型構(gòu)建的困難及不足，本實驗對現(xiàn)有方法進行了優(yōu)化，采用無呼吸機輔助呼吸模式，簡化了操作步驟，明顯減少學習時間，使該技術(shù)更為易學。在無呼吸機支持下，麻醉藥的劑量控制比較重要，麻醉深度以小鼠反應減弱，但是強刺激肢端有反應為宜，這樣不會導致麻醉過度死亡，而且術(shù)后恢復快，沒有發(fā)現(xiàn)麻醉低溫現(xiàn)象，在縮短手術(shù)時間的基礎上，也不需要術(shù)中增加麻醉劑量。本研究發(fā)現(xiàn)無呼吸機模式下的最大優(yōu)勢在于減少了氣道相關(guān)的嚴重并發(fā)癥，如氣管插管導致的喉頭水腫窒息，而且術(shù)后恢復快，術(shù)后1周死亡率低。在呼吸機支持下，胸廓上部受呼吸機頻率的作用在顯微鏡下有較大的振幅，對顯微手術(shù)的精準定位操作有較大的影響，容易誤傷主動脈，或刺破胸膜，增加手術(shù)風險及難度。我們發(fā)現(xiàn)即使在呼吸機支持下，一旦破壞胸膜的完整性，小鼠出現(xiàn)不規(guī)律呼吸后，甚難搶救成功。經(jīng)過優(yōu)化后，本實驗室后續(xù)學習該操作者僅需2～4周便能熟練掌握。

盡管如此，對該模型進行實驗時發(fā)現(xiàn)，小鼠1周圍手術(shù)期死亡率較高，約13%，死亡率低于相關(guān)文獻報道［7］。主要原因為小鼠進行顯微外科操作難度較大，主要有易損傷大血管及周圍組織導致手術(shù)中即刻發(fā)生大出血死亡，常見位置為開胸時損傷肋間動脈，縫針誤傷鎖骨下大靜脈，撥開胸腺時心房刺破;開胸時損傷胸膜導致氣胸死亡更為常見;難以弓下過結(jié)扎線導致鑷子扯拉主動脈弓導致破裂，或結(jié)扎線過緊導致墊扎針用力拉出撕破主動脈弓。因此為提高手術(shù)成功率，避免上述情況發(fā)生，術(shù)中的操作需注意以下幾點:1)開胸時組織剪要對準胸骨正中，盡量一刀到位，避免損傷肋間動脈。胸廓擴張時避免用銳利鑷子撥開組織，容易刺破胸膜，胸膜刺破時小鼠表現(xiàn)為突然呼吸深大或點頭樣呼吸，立即關(guān)閉胸腔有時或可挽救成功。2)尋找主動脈弓時分離周圍組織手法要細致，胸腺組織不要鉗夾，最好鈍性分離往腹側(cè)推壓，看到搏動的主動脈弓即可，避免使視野模糊導致容易損傷周圍血管組織。3)在絲線穿過主動脈弓時，容易過分牽拉主動脈弓導致破裂，我們采用自制打磨后的顯微鑷子，調(diào)整頭端彎曲度及銳利度，這樣過線時能夠很好的保持主動脈弓的原位及順利刺破弓下組織而不損傷主動脈弓。4)進行主動脈弓結(jié)扎時，結(jié)扎不易過緊，應松緊適度，以能順利抽出墊扎針為宜，避免墊扎針抽出時撕破主動脈弓。

早期判斷是否成功建立主動脈弓縮窄模型，可通過頸總動脈血流速度檢測，對比雙側(cè)頸總動脈的差異。由于主動脈弓縮窄后，右側(cè)頸總動脈承擔部分血液分流，術(shù)中即時表現(xiàn)為搏動增強，術(shù)后1周行頸總動脈彩超提示右側(cè)血流速度明顯增快。后期動脈模型的評價的關(guān)鍵在于確立心肌肥厚的時間，一般2～4周即可出現(xiàn)肥厚。縮窄越重，出現(xiàn)肥厚的時間越短，但是可能造成小鼠代償不足，出現(xiàn)心力衰竭死亡［8］。

本階段研究建立并優(yōu)化了TAC壓力超負荷心肌肥厚模型，優(yōu)化后的無呼吸機支持下模型構(gòu)建方法可以簡化操作步驟，提高小鼠術(shù)后1周內(nèi)的存活率，小鼠術(shù)后恢復快，縮短手術(shù)時間和學習時間。對小鼠TAC術(shù)后4周進行心臟超聲檢測提示模型構(gòu)建成功。本研究為單一中心小樣本實驗，研究結(jié)果可能受術(shù)者手術(shù)操作熟練度的影響，該方法的實用性仍需進一步探討，可供同行借鑒參考。

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