江西省結核分枝桿菌耐二線抗結核藥的分子學特征

袁小亮 張天托 朱家馨 鄭文爭 雷建平 涂少華 羅一鈞 劉惟優

·論 著 ·

江西省結核分枝桿菌耐二線抗結核藥的分子學特征

袁小亮 張天托 朱家馨 鄭文爭 雷建平 涂少華 羅一鈞 劉惟優

目的 初步明確江西省耐二線抗結核藥相關基因突變的特征，評價等位基因特異性多重PCR（multiplex allele-specific polymerase chain reaction，MAS-PCR）檢測二線抗結核藥耐藥性的可行性。方法 采用DNA測序方法和MAS-PCR技術，對江西省52株耐二線抗結核藥的結核分枝桿菌進行耐藥相關基因突變位點檢測。結果 DNA測序分析：39株耐氧氟沙星（Ofx）菌株中，32株存在gyrA基因錯義突變，2株發生gyrB基因錯義突變。29株耐卡那霉素（Km）或卷曲霉素（Cm）菌株中，22株為rrs1401位點A→G突變。52株耐二線抗結核藥的結核分枝桿菌，40株為北京基因型（76.92%，40/52），其中17株北京基因型菌株發生gyrA-GAC94GGC突變（42.50%，17/40），19株北京基因型菌株發生rrs-A1401G突變（47.50%，19/40）。北京基因型與基因突變類型gyrA-GAC94GGC和rrs-A1401G無明顯相關性（χ2=1.16、1.92，P值均＞0.05）。MAS-PCR檢測Ofx耐藥株的敏感度為61.54%（24/39），檢測Km或Cm耐藥株的敏感度為79.31%（23/29）。結論gyrA基因94位密碼子突變是江西省結核分枝桿菌Ofx耐藥的主要機制；rrs-A1401G突變則是Km或Cm耐藥的主要原因。MAS-PCR方法對于快速檢測二線抗結核藥的耐藥性有一定的臨床應用價值。

分枝桿菌，結核； 抗藥性，細菌； 抗生素類，抗結核； 卡那霉素； 卷曲霉素硫酸鹽； 聚合酶鏈反應； 江西

耐多藥（multidrug-resistant，MDR）和廣泛耐藥（extensively drug-resistant，XDR）結核病的出現對全球結核病防控提出了嚴峻挑戰。2007—2008年全國結核病耐藥基線調查顯示：肺結核耐多藥率為8.32%，廣泛耐藥率為0.68%［1］。二線抗結核藥是治療耐多藥結核病的主要藥物。研究提示：氟喹諾酮類藥物能明顯改善耐多藥結核病患者的預后；相反，對氟喹諾酮類耐藥意味著較低治愈率和更高的死亡率［2-3］。因此，快速明確二線抗結核藥的耐藥性，對于制定合理化療方案和評估耐多藥結核病患者的預后至關重要。不同地區耐藥相關基因突變類型和頻率不盡相同［4-5］，明確局部區域 Mtb耐二線抗結核藥的基因突變位點類型及頻率分布特征，將為臨床快速診斷耐二線抗結核藥的結核病提供重要的分子生物學信息。

近年來，等位基因特異性多重聚合酶鏈反應（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）已成功用于一線抗結核藥耐藥性的分析［6］，但其在二線抗結核藥耐藥性檢測的應用研究較少。此外，MASPCR對不同區域的結核分枝桿菌抗結核藥耐藥性的檢測效能（敏感度）差異可能很大。所以，筆者對來自江西省耐二線抗結核藥的結核分枝桿菌臨床分離株進行了MAS-PCR和耐藥相關基因DNA測序分析，初步明確該地區二線抗結核藥耐藥相關基因突變特征，探討MAS-PCR在二線抗結核藥耐藥性檢測的可行性。現將結果報道如下。

材料和方法

一、菌株來源和藥敏實驗

1.菌株來源：2010年7月至2011年6月期間篩選的52株耐二線抗結核藥的MDR結核分枝桿菌臨床分離株，來自江西省胸科醫院（MDR37株）和贛州市第五人民醫院（MDR15株）的52例肺結核患者。其中男35例，女17例，年齡18～76歲，平均（42.6±14.5）歲。52株耐藥結核分枝桿菌主要從肺結核患者的痰及肺泡灌洗液標本培養分離獲得。同時，以實驗室保存的30株敏感菌株作為陰性對照。實驗參照菌株H37Rv（ATCC27294）由江西省胸科醫院惠贈。參照文獻［7］進行菌株鑒定。

2.藥敏試驗：采用世界衛生組織全球結核病耐藥監測項目指南推薦的1%間接比例法進行藥敏試驗（drug sensitivity test，DST）［8］。藥敏羅氏培養基（嘉偉生物制品有限公司，杭州）藥物終濃度為：異煙肼（INH）0.20μg/ml，利福平（RFP）40μg/ml，氧氟沙星（Ofx）2μg/ml，卡那霉素（Km）30μg/ml，卷曲霉素（Cm）40μg/ml。

二、基因組DNA的提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說明書的步驟，提取結核分枝桿菌基因組DNA溶液約100μl（2.0～3.0μg）。

三、北京基因型菌株的鑒定

按照Chen等［9］建立的以RD105為分子標志的定向缺失多重酶鏈聚合反應技術（the RD105 deletion targeted multiplex PCR，DTM-PCR）對所收集的52株耐藥結核分枝桿菌進行北京基因型菌株鑒定。結核分枝桿菌如果存在RD105基因片段缺失則為北京基因型菌株，電泳圖上可見761 bp大小的條帶；RD105基因片段不缺失則為非北京基因型，電泳圖上可見1466 bp大小的條帶。

四、MAS-PCR方法檢測gyrA 90、94位密碼子和rrs 1401位點突變

目前認為，結核分枝桿菌產生Ofx耐藥主要與gyrA基因耐藥決定區突變有關，對Km和Cm耐藥主要與rrs基因突變有關。因此，本研究針對gyrA基因90、94位密碼子和rrs 1401位點突變進行MAS-PCR分析。MAS-PCR檢測的對象包括30株敏感陰性對照菌株、相應的耐藥臨床分離菌株及實驗參照菌株H37Rv。

1.引物設計：gyrA基因94位密碼子和rrs 1401位點突變檢測的引物設計參照文獻［10］進行。gyrA基因90位密碼子突變分析則根據結核分枝桿菌標準株H37Rv的gyrA基因全序列（NC-000962）和點檢原理自行設計內向引物I2（表1）。用于gyrA基因第94位密碼子MAS-PCR突變分析的引物包括gyrA正反向引物F、R和內向引物I1（表1）；相應地，gyrA基因第90位密碼子為gyrA正反向引物F、R和內向引物I2（表1），rrs 1401位點為rrs正反向引物F、R和內向引物I3（表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2.PCR擴增體系及反應條件：參照文獻［10］進行。

3.結果判讀：擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳120 V，30 min，0.5μg/ml EB染色，以電泳凝膠圖像分析系統（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）觀察結果。根據PCR原理，gyrA基因94位密碼子野生株可擴增出427 bp和260 bp 2條片段，而突變株相應的條帶260 bp缺失（圖1a）。類似地，gyrA基因90位密碼子野生株可見427 bp和252 bp 2條片段，突變株252 bp條帶缺失（圖1b）。rrs基因1401位點野生株可見481 bp和353 bp 2條片段，突變株353 bp條帶缺失（圖1c）。

表1 用于靶基因擴增及MAS-PCR反應的引物序列

圖1 MAS-PCR檢測結核分枝桿菌gyrA和rrs基因突變電泳圖

五、PCR-DNA測序分析

對結核分枝桿菌gyrA、gyrB和rrs基因核心突變區進行體外擴增，引物分別為gyrA-F、R，gyrB-F、R和rrs-F、R（表1）。退火溫度及擴增片段大小如表1所示。PCR產物送深圳華大基因測序。gyrA、gyrB和rrs擴增片段測序引物分別為gyrAR、gyrB-F和rrs-F。測序結果應用NCBI在線軟件Blast 2 Sequences（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）與標準株H37Rv相應序列進行比對分析。

六、統計學方法

應用SPSS 16.0軟件進行統計學處理。以χ2檢驗或Fisher確切概率法（當最小理論值小于5時采用）統計分析計數資料（構成比）的差異；在α= 0.05雙側檢驗水準下，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、耐藥表型和北京基因型菌株的鑒定

52株MDR結核分枝桿菌（其中16株XDR菌株）耐二線抗結核藥：Ofx 39株（75.00%），Km 28株（53.85%），Cm 14株（26.92%），具體見表2。

52株耐藥結核分枝桿菌中40株為北京基因型（40/52，76.92%），12株為非北京基因型（12/52，23.08%）。

二、DNA測序分析

1.gyrA和gyrB基因突變：除了參照菌株H37Rv和1株Ofx耐藥株，38株耐Ofx的臨床分離菌株及30株Ofx敏感的陰性對照菌株gyrA基因第95位點均存在AGC→ACC突變，第21位點均可見GAG→CAG錯義突變。39株耐Ofx菌株中，32株存在gyrA基因錯義突變，突變率為82.05%（32/39），涉及90（3/32，9.38%）、91（2/32，6.25%）及94位點（27/32，84.38%），其中以94位點GAC（天冬氨酸）→GGC（甘氨酸）突變最常見（20/32，62.50%）。只有2株耐Ofx菌株存在gyrB基因錯義突變，突變率5.13%（2/39）；其中1株MDR菌株gyrB基因第540位點GAA→GAC突變的同時伴有gyrA基因第94位點GAC→GGC突變。突變類型和頻率詳見表2。gyrA和gyrB基因突變聯合檢測Ofx耐藥性的敏感度為84.62% （33/39），6株Ofx耐藥菌株沒有發現突變。

表2 52株耐藥結核分枝桿菌表型耐藥模式和耐藥基因突變類型

2.rrs基因突變：30株Km及Cm敏感的陰性對照菌株均未發現突變。29株耐Km或Cm結核分枝桿菌中，6株rrs基因未發現突變；在發生突變的23株細菌中，22株為rrs1401位點A→G突變，另1株為rrs1402位點C→T堿基替換（表2）。DNA測序技術對該地區耐氨基糖苷類的MDR菌株檢出率為79.31%（23/29），以rrs-A1401G（95.65%，22/23）突變為主。

3.耐藥基因突變類型與北京基因型的關系：40株北京基因型耐藥菌株中，17株發生gyrAGAC94GGC突變（42.50%，17/40），19株發生rrs-A1401G突變（47.50%，19/40）。12株非北京基因型菌株中，3株發生gyrA-GAC94GGC突變，3株發生rrs-A1401G突變。統計分析提示：北京基因型與Ofx耐藥相關的最常見的基因突變類型gyrAGAC94GGC無明顯相關性（χ2=1.16，P＞0.05）；北京基因型與Km及Cm耐藥相關的最常見的基因突變類型rrs-A1401G無明顯相關性（χ2=1.92，P＞0.05）。

三、MAS-PCR檢測gyrA和rrs基因點突變分析

1.MAS-PCR檢測gyrA基因突變：在MASPCR檢測的69株（包括30株Ofx敏感的陰性對照菌株和39株Ofx耐藥的臨床分離株）結核分枝桿菌臨床分離株中，30株Ofx敏感株均未提示有突變。39株耐Ofx結核分枝桿菌中，24株提示有突變（表3）。經測序證實為94位點GAC→GGC或GAC→GCC突變的21株均為陽性，而存在90位點GCG→GTG突變的3株也為陽性。與比例法比較，敏感度為61.54%（24/39）；與DNA測序比較，敏感度為72.73%（24/33）。

表3 MAS-PCR和DNA測序技術檢測二線抗結核藥耐藥性的敏感度

2.MAS-PCR檢測rrs基因突變：在MAS-PCR檢測的59株（包括30株Km或Cm敏感的陰性對照菌株和29株Km或Cm耐藥的臨床分離株）結核分枝桿菌中，30株敏感株均未提示有突變。29株耐Km或Cm菌株中，23株提示有突變（表3）。經測序證實存在1401位點A→G突變的22株菌株均為MAS-PCR陽性，而存在1402位點C→T突變的1株卻錯判為1401位點A→G突變。與比例法比較，敏感度為79.31%（23/29）；與DNA測序比較，敏感度為100.00%（23/23）。

討 論

一、結核分枝桿菌耐二線抗結核藥物的相關基因突變特征分析

DNA測序分析提示：38株耐Ofx菌株及30株敏感陰性對照菌株的gyrA基因第95位點均存在AGC→ACC突變，第21位點均可見GAG→CAG錯義突變。第95位點AGC→ACC突變為天然多態現象［11］。第21位點GAG→CAG突變很少報道，但最近已證實與耐藥無關，認為是天然多態現象和物種進化遺傳標志［12］。本研究DNA測序技術檢測MDR菌株耐Ofx的敏感度為84.62%，與其他研究報道相一致［13-14］。32株gyrA基因錯義突變分別發生第90（9.38%）、91（6.25%）和94 （84.38%）位密碼子上，未發現既往文獻報道的第74和88位密碼子突變［11-12］。只有2株gyrB基因點突變陽性。這說明gyrA基因突變是江西地區結核分枝桿菌對氟喹諾酮產生耐藥的主要機制，以94位密碼子突變（27株）為主。本實驗中在gyrA和gyrB基因耐藥決定區均無突變的6株耐Ofx結核分枝桿菌耐藥機制尚不清楚，有待進一步研究。此外，DNA測序技術對該地區耐氨基糖苷類的MDR菌株檢出率為79.31%（23/29），以rrs A1401G（95.65%，22/23）突變為主。

有研究表明北京基因型與rpoB基因突變、katG基因第315位突變、rpsL基因第43位突變及gyrA基因第94位突變有顯著相關性［14-16］；但也有報道北京基因型與結核分枝桿菌耐藥基因突變位點分布并無相關性［17-18］；本研究結果支持后者。各地報道的北京基因型與結核分枝桿菌耐藥基因突變種類的相關性有所不同，其原因可能是區域差異所致［18］。此外，本研究樣本選擇局限于耐多藥結核分枝桿菌以及樣本量偏小，也是影響研究結果的重要因素。

二、MAS-PCR技術檢測原理及效能分析

MAS-PCR方法常用于已知突變基因的檢測。其實驗原理基于耐熱Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶校正活性，在同一個反應體系中設計兩條外引物和一條內引物，其中內引物的3′端末端正好對應待測突變位點，若此堿基對形成錯配，鏈延伸反應就會因3′，5′-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻。對于野生型菌株，3條引物均可以起作用，合成2種PCR產物；而當待測位點第1或第2個核苷酸發生突變時，在嚴謹的條件下，內引物作用的效率大大降低，因此只能見到外引物合成的長片段［19-20］。與常規藥敏結果比較，本研究MAS-PCR對氟喹諾酮類藥物耐藥株的檢出率為61.54%，這一結果稍高于夏強等［20］的研究報道；與DNA測序敏感度（84.62%）比較，兩者差異有統計學意義（χ2=4.05，P＜0.05）。與比例法和DNA測序相比，MAS-PCR對于耐氨基糖苷類結核分枝桿菌的檢出率分別為79.31%和100.00%。相對Ofx，MAS-PCR對耐Km或Cm結核分枝桿菌顯示了更好的敏感度。其原因在于結核分枝桿菌對Km、Cm和Ofx耐藥機制不同造成的，Km或Cm耐藥相關的rrs基因突變類型較單一，而Ofx耐藥相關的gyrA基因突變位點分布及頻率變化則復雜得多。

三、MAS-PCR技術檢測效能的改進措施及缺陷分析

不同地區耐藥相關基因突變類型和頻率不盡相同，因此，MAS-PCR檢測敏感度的區域差異可能很大。本研究DNA測序顯示江西省39株耐Ofx結核分枝桿菌菌株中有5株存在gyrA基因第94位點GAC→AAC突變，如果針對這種突變進行引物設計將之覆蓋，MAS-PCR的敏感度可能將從61.54%（24/39）提高到74.36%（29/39）。此外，1株rrs1402位點C→T突變通過MAS-PCR卻錯判為1401位點A→G突變，所幸rrs1402位點C→T突變引起了結核分枝桿菌 Km耐藥［21］。如果其他與耐藥無關的基因多態性被擴增，就會導致假陽性。此外，由于分子生物學方法本身的限制，DNA測序和MAS-PCR分析結果陰性的樣本并不能排除表型耐藥的可能［22］。

目前，DNA測序技術是分子生物學檢測結核分枝桿菌耐藥性的金標準。MAS-PCR方法不能明確耐藥相關基因突變的堿基置換，敏感度也不及DNA測序技術，但它的優勢在于操作簡便、經濟，不需要昂貴的儀器，幾個小時內就可以得到結果［6］。此外，常規藥敏檢測方法耗時長（數周），延誤患者治療，導致耐藥發生和結核傳播的機會增加［23-24］。因此，在結核病高發和耐藥形勢嚴峻的區域，對于快速診斷耐二線抗結核藥的結核病、指導臨床合理用藥，MAS-PCR不失為一種有應用價值的檢測手段。

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Molecular characteristics of the second-line antituberculosis drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Jiangxi province

YUAN Xiao-liang*，ZHANG Tian-tuo，ZHU Jia-xin，ZHENG Wen-zheng，LEI Jian-ping，TU Shao-hua，LUO Yi-jun，LIU Wei-you.*Department of Respiratory Medicine，the 1st Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

ZHANG Tian-tuo，Email：zhtituli@163.com

Objective To initially ascertain molecular characteristics of the second-line antituberculosis drugresistant M.tuberculosis clinical isolates in Jiangxi，and to evaluate the feasibility of multiplex allele-specific polymerase chain reaction（MAS-PCR）assay for the detection of the second-line drug resistance in M.tuberculosis clinical isolates.Methods Fifty-two second-line drug-resistant isolates and 30 pan-susceptible isolates from Jiangxi province were analyzed for gene mutations related to the second-line drug resistance using MAS-PCR and DNA sequencing.Results DNA sequencing indicated that 32 of 39 ofloxacin（Ofx）-resistant isolates displayed missense mutations in gyrA gene，and the most common mutations were observed at codon 94（n=27），and only 2 isolates showed single-point mutation in gyrB gene.In addition，22 of 29 kanamycin（Km）-or capreomycin（Cm）-resistant isolates had an A-to-G transition at nucleotide position 1401 of rrs gene.It is shown that the Beijing genotype was predominant（76.92%，40/52）among the 52 drug-resistant strains.Of 40 Beijing genotype strains，17 strains （42.50%）displayed gyrA-GAC94GGC mutations，and 19 strains（47.50%）showed rrs-A1401G mutations.No relationship could be demonstrated between Beijing genotype and gyrA-GAC94GGC or rrs-A1401G mutations（χ2= 1.16，1.92，P value＞0.05）.In comparison with the phenotypic data，the sensitivities of the detection of Ofx resistance，and Km or Cm resistance using MAS-PCR were 61.54%（24/39）and 79.31%（23/29）respectively.Conclusion In Jiangxi province，gyrA mutation is the main molecular mechanism of Ofx resistance in M.tuberculosis，and an A1401G mutation in the rrs geneis the main cause of Km or Cm resistance.MAS-PCR，an assay with technical simplicity，short turnaround time，and low cost，could be useful for screening second-line drug-resistant M.tuberculosis，particularly in resource-limited areas with a high prevalence of tuberculosis and drug resistance.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance，bacterial； Antibiotics，antitubercular； Kanamycin； Capreomycin sulfate； Polymerase chain reaction； Jiangxi

2013-04-01）

（本文編輯：張曉進）

341000贛州，贛南醫學院第一附屬醫院呼吸科（袁小亮、劉惟優）；中山大學附屬第三醫院呼吸科（張天托、朱家馨、鄭文爭）；江西省胸科醫院結核科（雷建平），檢驗科（涂少華）；江西省贛州市第五人民醫院檢驗科（羅一鈞）

張天托，Email：zhtituli@163.com