結核性腦膜炎臨床分離株基因型和耐藥表型的特征分析

王婷 趙雁林 劉家云 逄宇 周楊 趙冰 趙鋼

·論 著 ·

結核性腦膜炎臨床分離株基因型和耐藥表型的特征分析

王婷 趙雁林 劉家云 逄宇 周楊 趙冰 趙鋼

目的 了解導致結核性腦膜炎（TBM）的致病菌在基因型和耐藥表型方面的特征。方法 利用間隔區寡核苷酸分型法（Spoligotyping）和數目可變串聯重復序列（VNTR）分型法對25株TBM臨床分離菌株進行基因分型；采用MGIT（mycobacteria growth indicator tube）960液體和比例法固體藥敏試驗分別對所選15種藥物：異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）、鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）、卷曲霉素（Cm）、莫西沙星（Mfx）、氧氟沙星（Ofx）、左氧氟沙星（Lfx）、對氨基水楊酸（PAS）、乙硫異煙胺（Eto）、丙硫異煙胺（Pto）、環絲氨酸（Cs）進行藥敏實驗。結果 Spoligotyping分型法確定了在25株TBM臨床分離株中有20株為北京基因型，占80.0%（20/25），2株為T1基因型，另外3株分別為T2型、LAM6型及未知型；VNTR有2株成一簇，基因型一樣；25株TBM分離株中耐多藥結核性腦膜炎（MDR-TBM）占12.0%（3/25），廣泛耐藥結核性腦膜炎（XDR-TBM）占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京基因型；任意耐藥的菌株占48.0% （12/25），其中83.3%（10/12）為北京基因型；全敏感者占52.0%（13/25），其中76.9%（10/13）為北京基因型。結論 北京基因型在耐藥TBM中所占比例很高，尤其是 MDR-TBM，較其他基因型更易引起腦脊液生化的改變；耐氟喹諾酮類的菌株所占比例最少，提示臨床上氟喹諾酮類藥物對治療TBM會有很好的療效。

結核，腦膜； 分枝桿菌，結核； 基因型； 抗藥性，細菌； 寡核苷酸分型； 小衛星重復

表1 25個VNTR位點、引物序列，及其在H37Rv中的重復次數

Mtb基因分型是識別結核病人群間傳播的重要方法，可用于更準確地識別結核病的暴發、流行及其傳播模式。近年來，基于Mtb散在分布重復單位（mycobacterial interpersed repetitive units，MIRUs）的多位點可變數量串聯重復序列分析（mutiple loci VNTR analysis，MLVA）分型方法在國內外 Mtb基因分型研究中越來越受到關注。它是以PCR為基礎，利用基因組中特定位點可變數量串聯重復序列（VNTR），即不同菌株間拷貝數差異鑒定菌株，從而進行基因分型。本實驗選取了文獻報道［5］的25個分辨力較高的MIRUs的位點，對25 株TBM臨床分離株進行PCR擴增，在瓊脂糖凝膠上通過電泳確定擴增產物長度。再根據各位點不同重復單位拷貝數來區別并分型。此法操作簡單，對基因型別的分辨能力高于IS6110限制性內切酶片段長度的多態性法（IS6110 restriction fragment length po1ymorphism，IS6110-RFLP）和Spoligotyping，且試驗成本較低，適合在結核病高負擔的中低收入國家和地區應用［6］。傳統的 Mtb分型方法是描述IS6110限制性內切酶片段長度的多態性，并被認為是識別 Mtb基因型的“金標準”，但耗時，并需要用特殊軟件分析，現使用較少［7］；在我國流行的Mtb中北京基因型是一個重要的種類，具有特異分子標志RD105基因缺失區，表現為1～34個雜交信號缺失。基于直接重復區（DR）缺失的間隔區寡核苷酸分型（spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping），具有敏感度高、重復性好、特異度強等特性，主要用于鑒定 Mtb家族的北京型和非北京型［8］。使用MLVA和Spoligotyping定義Mtb基因型，并有效區別北京基因型中各種亞型，可以更好地了解TBM臨床分離株基因型的特點［9］。

鑒于此，本研究利用Spoligotyping、VNTR分型、比例法固體藥敏和液體藥敏對TBM的臨床分離株在基因型和耐藥性方面的特征作了初步分析，并嘗試與肺結核的臨床分離株各項檢測結果進行比較，以了解兩者之間有無差異。

材料和方法

一、材料和試劑

1.菌株來源：陜西省西安市第四軍醫大學西京醫院2010年7月至2011年6月收集了500例確診TBM并住院患者的腦脊液標本，經BACTEC MGIT 960快速培養結核分枝桿菌陽性者有25例，并經PCR、GeneXpert鑒定是Mtb。這25例患者包括男8例，女17例，中位年齡26歲，年齡范圍3～82歲，15～60歲占68.0%（17/25）；28.0%（7/25）有結核病接觸史，40.0%（10/25）有肺結核病史；68.0%（17/25）經一線藥物、16.0%（4/25）經氟喹諾酮類藥物治療過，20.0%（5/25）的患者死亡，72.0% （18/25）的患者肺部有空洞，44.0%（11/25）有高血壓或糖尿病等并發癥。H37Rv標準株由國家參比實驗室提供，作為對照株。

2.診斷標準：500例患者根據2009年國際TBM臨床診斷標準確診為TBM［9］，這些患者必須符合以下3個診斷標準中的任意一項：（1）腦脊液或組織中鏡檢查到抗酸桿菌；（2）分離培養出 Mtb；（3）商業化核酸擴增檢測顯示陽性。

3.試劑和儀器：所用試劑有2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）、BestaTM瓊脂糖（賽百盛基因技術有限公司）、DNA Ladder Marker （TaKaRa公司）、凝膠成像儀（FOTO DYNE公司）、Spoligotyping試劑盒，Miniblotter MN45（荷蘭Isogen Bioscience公司）、鏈霉親和素（Sigma公司）、化學發光檢測系統（enhanced chemiluminescence，ECL）（美國Amersham Bioscience公司）、全自動BACTEC MGITTM960TB系統、MGIT（mycobacteria growth indicator tube）960液體培養基、MGIT生長添加劑（美國BD公司）。L-J固體培養基依據《結核病診斷實驗室檢驗流程》［10］，由國家參比實驗室制備。

用平板菌落計數方法，將樣品液稀釋106～107倍到每個平板生長30～300個菌落為計數的合適稀釋度，涂布于MRS固體培養基上，將涂布樣品的MRS固體培養基于30 ℃培養箱中培養2天后計數[17]。

二、檢測方法

1.DNA的制備：取一接種環經L-J固體培養基培養2～3周后，將生長形態良好的菌體，溶于400μl TE緩沖液（p H值為8.0）中，80℃、30 min水浴滅活，渦漩振蕩混勻，沸水浴煮沸30 min，12 000 r/min，離心半徑10 cm，離心2 min，取上清備用，-20℃保存。

2.引物設計與合成：25個VNTR位點引物設計見表1，由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

3.PCR反應體系和條件：VNTR分型采用20.0μl反應體系，其中含上、下游引物（10μmol/L）各1.0μl，2×Taq PCR Master Mix 10.0μl，雙蒸水6.0μl，DNA模板2.0μl。PCR擴增條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，因每條引物不同，因此退火溫度從58℃到62℃不等，退火時間為30 s，72℃延伸1 min，30個循環之后72℃再延伸7 min。Spoligotyping采用25μl反應體系，其中引物DRa （5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′）和DRb（5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′）分別為1.0μl，2×TaqPCR Master Mix為12.5μl，DNA模板2.0μl，雙蒸水8.5μl。PCR擴增反應條件為96℃預變性3 min，96℃變性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，30個循環后72℃再延伸5 min。

4.抗結核藥物：所選15種藥物分別為：異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、吡嗪酰胺（PZA）、鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）、卷曲霉素（Cm）、莫西沙星（Mfx）、氧氟沙星（Ofx）、左氧氟沙星（Lfx）、對氨基水楊酸（PAS）、乙硫異煙胺（Eto）、丙硫異煙胺（Pto）、環絲氨酸（Cs），均購自Sigma-Aldrich公司（St.Louis，MO，USA）。INH、EMB、PZA、Km、Am、Cm、Mfx、PAS、Cs、S溶于雙蒸水；RFP、Eto、Pto溶于DMSO有機溶劑中；Lfx、Ofx溶于NaOH（0.1 mol/L）中。所有藥物在-20℃～-4℃存放。

5.含藥培養基藥物的終濃度：根據2008年WHO最新指南［11］，MGIT960液體藥敏試驗選擇14種抗結核藥物，即：INH（0.1μg/ml）、RFP（1.0 μg/ml）、EMB（5.0μg/ml）、PZA（100.0μg/ml）、S （1.0μg/ml）、Km（2.5μg/ml）、Am（1.0μg/ml）、Cm（2.5μg/ml）、Mfx（0.5μg/ml，2.0μg/ml）、Ofx （2.0μg/ml）、Lfx（1.5μg/ml）、PAS（4.0μg/ml）、Eto（5.0μg/ml）、Pto（2.5μg/ml）；固體藥敏試驗選擇12種抗結核藥物，即：INH（0.2μg/ml）、RFP （40.0μg/ml）、EMB（2.0μg/ml）、S（4.0μg/ml）、Km（30.0μg/ml）、Am（30.0μg/ml）、Cm（40.0μg/ml）、Ofx（4.0μg/ml）、Lfx（4.0μg/ml）、PAS（1.0μg/ml）、Pto（40.0μg/ml）、Cs（30.0μg/ml）。

6.比例法固體藥敏試驗：取L-J固體培養基2～3周后生長狀態良好的菌落，分別在含藥培養基上接種0.01 ml稀釋菌液，菌液用生理鹽水將一個麥氏濃度（107CFU/ml菌液）分別稀釋10-2和10-4倍。同時將不加菌液的L-J固體培養基作為空白對照，放入37℃溫箱中孵育4周后觀察生長情況并計算菌落百分率。根據我國實驗室診斷標準對耐藥結果進行判定：耐藥百分率=（含藥培養基的菌落數/對照培養基的菌落數）×100%。耐藥百分率＜1%為敏感，≥1%為耐藥［12］。

7.液體MGIT960藥敏試驗：嚴格地為每個MGIT960培養管添加800μl MGIT生長添加劑。取L-J固體培養基2～3周后生長狀態良好的菌落，分別在已加藥的MGIT培養管中加入500μl稀釋菌液，菌液用生理鹽水將0.5個麥氏濃度稀釋5倍，空白對照稀釋100倍（因PZA所用培養管是酸性的，與其他培養管不同。PZA的空白對照稀釋10倍），置入MGIT960儀器中37℃培養。孵育至儀器報陽，最多培養6周，如未能生長，儀器將標記為陰性。

8.結果檢測：VNTR實驗中取5μl PCR擴增產物，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結束后在凝膠成像儀下觀察條帶并拍照儲存。Spoligotyping試驗中將PCR擴增產物與結合有43個間隔區寡核苷酸探針的Biodyne C膜進行雜交。最后，通過鏈霉素親和素-過氧化物酶連接體（streptavidin-peroxidase conjugate）酶孵育及CDP-star檢測，X線曝光獲取結果。

9.結果分析：（1）VNTR結果采用Gel-Pro analyzer 3.1軟件對凝膠進行數字化處理，確定產物大小，據此計算每個VNTR位點重復單位的重復次數，并形成一組編碼。Spoligotyping結果為經二進制及八進制數轉換后形成一組編碼，再用BioNumerics（Version 5.0）數據庫軟件對兩種分型實驗結果進行聚類分析，將實驗菌株進行分型處理，揭示菌株間的相互關系。根據VNTR基因分型結果，設計調查表，收集成簇菌株的患者資料，用以追蹤同一簇患者間的相互傳播途徑，并分析其與耐藥結果的相關性。（2）根據各位點重復次數計算位點的分辨率：本實驗采用計算Hunter-Gaston分辨率指數（Hunter-Gaston diversity index，HGDI）來分析各位點的分辨率和合并分辨率，數值在0～1之間，即實驗總體中的2個無關樣本能夠分到不同型別中的能力［13］，數值越大，分辨率越大。計算公式為

公式中N為所有菌株數，S為分型的型別數，nj表示在j型別中的菌株數［14］。（3）計算菌株成簇率：實驗結果完全相同的菌株定義為一簇，成簇率為成簇菌株占總試驗菌株的百分率。

10.統計學分析：應用SPSS 16.0進行Fisher精確檢驗，以分析北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率，以P＜0.05為差異有統計學意義。

11.質量控制：質控均以標準株H37Rv和陰性對照進行。H37Rv的Spoligotyping結果表現為20、21、33～36的間隔區雜交呈陰性，其他間隔區雜交均為陽性，說明質控合格，若不一致，說明不合格。對于不合理的質控結果，采取重新檢測質控樣品重新進行試驗。

結 果

一、Spoligotyping基因分型結果

從圖1中可以看出TBM臨床分離株被聚為7類，其中以典型北京基因型（1～34間隔區缺失）為主，占80.0%（20/25）。23、26為T1型，15為T2型，8為未知型（表2）。

二、北京基因型菌株與耐藥表型的關系

從表3中可看出，25株TBM分離株中MDR-TBM 占12.0%（3/25），XDR-TBM占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京型；任意耐藥的菌株占48.0%（12/25），83.3%（10/12）是北京型；全敏感的菌株占52.0%（13/25），76.9% （10/13）是北京型。用SPSS 16.0對結果進行Fisher精確檢驗，顯示北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率之間的差異無統計學意義（P= 1.000）。

三、VNTR位點多態性檢測

本實驗共選取了25個特異性較好的VNTR位點，對TBM臨床分離菌株基因組進行擴增。

圖2 A和B檢驗的是VNTR3820和Qub11b位點的多態性，結果顯示各菌株的擴增產物大小差別很大，分辨率最高。實驗中有些擴增位點可獲得完整的數據結果，如圖2A；但有些位點沒有清晰的條帶，需要經過多次不同退火溫度的擴增，才能獲得清晰的電泳條帶以判斷產物大小，如圖2B中19號TBM臨床分離株。最終，將實驗獲得的25個VNTR位點的完整數據結果作聚類分析（圖3）。

圖1 Spoligotyping分型實驗結果及聚類分析圖

表2 25株TBM臨床分離株在SpolDB 4.0中的Spoligotyping分型結果

表3 北京家族菌株與15種藥物耐藥的相關性

圖2 結核性腦膜炎臨床分離株在VNTR3820位點和Qubllb位點的多態性檢測結果

四、VNTR結果

由于多個VNTR位點與Spoligotyping聯合使用的分辨率已經能夠達到IS6110-RFLP水平，加之操作簡便，現已基本取代了后者，成為對 Mtb分型的標準方法。通過網站“http：//www.hpa-bioinfotools.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl”計算本實驗中25個VNTR位點的HGDI值后，發現VNTR3820 （HGDI=0.877）、Qub11b（HGDI=0.803）、MIRU26（HGDI=0.744）、Qub26（HGDI=0.687）、VNTR1955（HGDI=0.621）對所有TBM臨床分離菌株有較高的分辨率。VNTR3820（HGDI=0.805）、Qub11b（HGDI=0.795）、MIRU26（HGDI=0.676）、Qub26（HGDI=0.648）對北京型TBM臨床分離株有較高分辨率。VNTR3820、Qub11b、MIRU26、Qub26、VNTR1955、Mtub04、MIRU10、MIRU31、MIRU39、Mtub39、ETRA、Mtub30、MIRU4、MIRU40、VNTR4120、ETRC、MIRU23、MIRU16、MIRU27、MIRU2對非北京型TBM臨床分離株有較高分辨率，HGDI值高于0.600。分辨率最差的位點是MIRU24，HGDI值＜0.400。通過上述公式算出25個位點對25株臨床分離株的綜合分辨率為0.997；成簇率為8%（2/25）。此外，VNTR將TBM臨床分離株分成完全獨立的24個基因型，可歸為3類；其中23和26號菌株成一簇，基因型一樣（圖3）。

討 論

一、TBM與肺結核在基因型方面的差異性

在此次研究中獲得了患者的一些基本信息（性別、年齡、既往史、結核病史、合并肺結核、一線藥治療診療情況、患者接觸史等），能確定彼此之間的流行病學聯系。從圖1、3中可以看出23和26號菌株成一簇，基因分型結果相同。查閱病歷資料后發現這2例患者住院日期相近，均為第一次入院，但所住醫院地處西安市不同片區，因此排除院內感染的可能。2例患者性別均為男性，年齡均在7歲以下，都未患過肺結核，入院時根據臨床表現和實驗室檢查進行TBM評分［8］，均＞6分，送檢日期為同一天，腦脊液中分離培養Mtb時間均為2周左右，二者對一線藥物的抗結核治療均有效，腦脊液鏡下均未見抗酸桿菌，ESAT-6均為陽性，腦脊液細胞學檢查中發現淋巴細胞數均＞63%，中性粒細胞均＜10%，單核細胞均＞9%，漿細胞均為0.5%，腦脊液生化檢查發現葡萄糖含量均＜3.9 mmol/L，蛋白含量均＞0.4 g/ L，氯含量均低于125 mmol/L。但由于無法獲知2例患者入院前有無接觸或其他接觸史，無法判斷是否由相互傳染所致，因此只能推斷他們可能來自同一傳染源。

圖3 VNTR分型實驗結果及聚類分析圖

本實驗中筆者發現TBM臨床分離株和肺結核臨床分離株結果都比較分散，具有各種基因型別［15］。選取的25個位點綜合分辨率高，HGDI值可達到0.997，其中Qub11b、MIRU26和Qub26分辨率最高，有文獻報道這25個位點用于肺結核的VNTR分型，分辨率也可＞0.900［15］；從Spoligotyping分型后在SpolDB 4.0中的家族類型中可以看出T1、T2、Beijing、LAM6型均可引起TBM，而這些基因型同樣可以引起肺結核；據文獻報道，目前中國最流行的是北京型菌株，北京型菌株是感染肺結核的優勢菌株［16］。25個TBM臨床分離株均來自西北地區，以北京型為主，這點也與文獻報道的陜西地區肺結核聚類情況相似［17］。這些發現提示，北京型可能也是感染TBM的優勢菌株并與其發病有關，TBM感染菌株與肺結核感染菌株在基因分型上可能沒有明顯差別。

二、TBM與肺結核在耐藥表型方面的差異性

25株TBM分離株中MDR-TBM占12.0% （3/25），XDR-TBM占4.0%（1/25），耐氟喹諾酮類的菌株占8.0%（2/25），都屬于北京型；任意耐藥的菌株占48.0%（12/25），其中83.3%（10/12）是北京型；全敏感的菌株占52.0%（13/25），其中76.9% （10/13）是北京型。耐氟喹諾酮類的菌株所占比例最少，耐一線藥物的菌株所占比例最高。越南有文獻報道，TBM耐多藥率（2.5%）要低于肺結核耐多藥率（5.9%）。因此，目前對于MDR-TBM的問題還未普遍受到關注。印度有文獻報道，大多數TBM對一線藥敏感（82.2%），有12.5%對異煙肼耐藥［18］。本實驗中可以看出中國MDR-TBM所占比例高于其他發展中國家，但仍低于中國耐多藥肺結核所占比例（25.6%）［19］。由此可以看出，北京型可能與TBM和MDR-TBM的發病有關，是肺結核和結核性腦膜炎的優勢菌株；雖然本實驗中北京基因型菌株耐藥率和非北京型菌株的耐藥率之間的差異無統計學意義，但很可能與樣本量少有關，因此不能就此下否定結論。此外，筆者也發現氟喹諾酮類藥物在治療肺結核和結核性腦膜炎方面都具有較好的效果［20］，一線藥物對TBM的治療效果要優于肺結核。

大多數人感染Mtb后引起的是肺結核，Mtb也可通過血腦屏障后引起TBM。本實驗中25例患者有18例肺部有結核病灶，說明大多數TBM患者可伴有肺結核，但不是每個TBM患者肺部都有結核病灶。被感染者感染的雖然都是 Mtb，但為何有些患者沒有患肺結核，卻有TBM？筆者認為，導致這種現象的原因可能是存在特異性感染肺結核的菌株型別、特異性感染TBM的菌株型別和均可感染肺結核和TBM的菌株型別，如果患者僅感染了嗜腦組織的Mtb，肺部就不會有病灶。

但由于TBM的發病率、診斷率不高，臨床上可收集用于檢測的腦脊液量有限，加上Mtb為胞內寄生菌，因此可從TBM患者腦脊液中分離培養獲得的菌株數量很少，導致統計學沒有意義，不能充分說明此假設的可靠性。若能擴大樣本量，可能會使推斷更據說服力。如果經擴大樣本量后能發現某些基因型只能導致TBM而不能導致肺結核，并且耐藥譜也不同，則對臨床用藥會有很大幫助。若發現導致TBM的基因型均能導致肺結核，則對于只患TBM而未合并肺結核的患者來說，原因有待探討。本實驗可以看出，從TBM和肺結核患者體內分離培養出的 Mtb具有相似基因型和耐藥譜，治療方法也沒有很大差別。這就說明導致這種病因學差異性的原因與 Mtb的基因型和耐藥譜關系不大，可能與Mtb的嗜組織性、血腦屏障、人體免疫系統、人體遺傳多態性和特異感染途徑有關，從而造成不同組織的病理改變。此外，本課題對于TBM的基礎研究，很好地擴展了對結核病的研究范圍，有助于解決臨床上的諸多問題。比如，同樣是不耐藥的 Mtb，為何對肺結核療效好的藥物對結核性腦膜炎的療效卻不好？相信這將是結核病基礎和臨床研究的新方向，值得每個學者為之探索發現。

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The characteristic analyses in genotype and drug resistance of clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis

WANG Ting*，ZHAO Yan-lin，LIU Jia-yun，PANG Yu，ZHOU Yang，ZHAO Bing，ZHAO Gang.*Department of Neurology，Center for Clinical Laboratory Medicine，Department of Infectious Diseases，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

ZHAO Gang，Email：zhaogang@fmmu.edu.cn

Objective To study the characteristics in genotype and drug resistance of clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis.Methods Twenty-five clinical isolates from the patients with tuberculous meningitis（TBM）were analyzed by Spoligotyping，variable numbers of tandem repeats（VNTR），15 antituberculosis drug susceptibility testing methods，in which 15 drugs were as following：isoniazid，rifampicin，ethambutol，pyrazinamide，streptomycin，kanamycin，amikacin，capreomycin，moxifloxacin，ofloxacin，levofloxacin，para amino salicylic acid，ethionamide，prothionamide，cycloserine.Results Of 25 M.tuberculosis isolates，20（80.0%）were Beijing genotype，2 were T1 genotype，3 were other genotypes（including T2，LAM6，and unclassified genotype）. 12.0%（3/25）were multi-drug resistant（MDR），and 4.0%（1/25）strains were extensive drug-resistant（XDR）. 8.0%（2/25）strains were resistant to fluoroquinolones，all belong to Beijing genotype.48.0%（12/25）strains were resistant to any drug，in which 83.3%（10/12）were Beijing genotype；52.0%（13/25）strains were sensitive，in which 76.9%（10/13）strains were Beijing genotype.Conclusion Beijing genotype strains were possibly associated with drug-resistant tuberculosis and may act as the main epidemic strain of TBM.Few strains were resistant to fluoroquinolones，which may play an important role in TBM treatment.

Tuberculosis，meningeal； Mycobacterium tuberculosis； Genotype； Drug resistance，bacterial；Spoligotyping； Minisatellite repeats

2013-07-16）

（本文編輯：張曉進）

國家科技重大專項（2012ZX10003004）

710032西安，第四軍醫大學西京醫院神經內科（王婷、趙鋼），檢驗科（劉家云）；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心 國家結核病參比實驗室（趙雁林、逄宇、周楊、趙冰）

趙鋼，Email：zhaogang@fmmu.edu.cn