39株對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株23S r RNA檢測結果分析

鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張院良

·論 著 ·

39株對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株23S r RNA檢測結果分析

鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張院良

目的 分析對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株23SrRNA的A2058位點的變化。方法 選擇我院菌株庫的結核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對全部抗結核藥物敏感的結核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時對克拉霉素敏感的結核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株；此外，還有結核分枝桿菌標準株H37Rv 1株。對結核分枝桿菌23S r RNA行PCR檢測和測序。結果 經檢測，H37Rv標準株沒有A2058突變，只有1株廣泛耐藥臨床分離株檢測有A2058A-G的突變，其他臨床分離株均沒有突變，在耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株中占2.56%（1/39），在廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株中占1/10。結論 結核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制中，A2058突變可能不是產生對克拉霉素耐藥的主要機制。結核分枝桿菌產生對克拉霉素耐藥的機制有待進一步研究。

分枝桿菌，結核； 克拉霉素； RNA，核糖體，23S； 抗藥性，細菌

在抗結核藥物中，克拉霉素屬于第五類抗結核藥物，WHO建議用于抗結核治療的大環內酯類藥物僅有克拉霉素［1］。雖然效果不是很確定，但在耐多藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis），廣泛耐藥結核病（extensively drug-resistant tuberculosis）的治療中，往往需要聯合使用其組成治療方案。而在耐多藥結核病、廣泛耐藥結核病的體外藥敏試驗中，克拉霉素對此類細菌常有效，這也是選擇克拉霉素的原因。克拉霉素在非結核分枝桿菌中是主要的治療藥物，而其產生耐藥的機制主要是在23S r RNA中的A2058位點的突變［2］，筆者通過檢測對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株的23S rRNA，了解結核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制是否也有A2058位點的突變。

資料和方法

一、資料

1.菌株：取我院菌株庫的結核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對全部抗結核藥物敏感的結核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時對克拉霉素敏感的結核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時對克拉霉素耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株。將菌株庫臨床分離株放在36℃溫箱復蘇，行羅氏培養并進行菌型鑒定及藥物敏感性試驗［3］。因目前國內外沒有可參考的克拉霉素耐藥藥物濃度，克拉霉素藥物濃度檢測采用微量肉湯稀釋法，依據美國臨床和實驗室標準協會指南（The guidelines of the clinical and laboratory standards institute），把克拉霉素的最低抑菌濃度（MIC）定為15μg/ml［4］。1株為H37Rv標準株。復蘇的結核分枝桿菌臨床分離株用生理鹽水洗脫菌體，80℃滅菌30 min；離心收集菌體，—20℃保存備用。

2.PCR引物：P1上游引物：5′-CCCAAACCGACACAGGTGGTCA-3′，P1下游引物：3′-AAACTACCCGCCAGGCACTGTC-5′［5］，513 bp。P2上游引物：5′-CCGTAACTTCGGGAGAAGGG-3′，P2下游引物：3′-CCAAACCATCCCGTCGATAT-5′［6］，819 bp。引物均由香港Invitrogen公司提供。

3.標準株：結核分枝桿菌標準株H37Rv由香港中文大學威爾斯親王醫院微生物實驗室提供。

二、方法

1.體系配制：在65支（包括1株H37Rv標準株）聚合酶鏈反應（PCR）反應管中依次加入40μl滅菌蒸餾水、5μl 10×PCR緩沖液、0.75μl脫氧核糖核苷酸（d NTP）混合液（濃度20 mmol/L）、0.25μl上游引物、0.25μl下游引物、2.5μl氯化鎂（濃度25 mmol/L）和1μl DNA模板，最后加入0.25μl Taq酶并混勻。

2.P1 PCR擴增程序：預變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火62℃30 s；延伸70℃45 s；35個循環；最后延伸72℃10 min；PCR產物4℃保存。P2 PCR擴增程序：預變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火55℃30 s；延伸70℃45 s；35個循環；最后延伸72℃10 min；PCR產物4℃保存。

3.凝膠電泳：將PCR產物通過2%非變性凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠掃描及儲存。

4.DNA序列分析：將PCR引物作為測序引物，序列測定由香港Tech Dragon Limited公司完成，對序列進行BLAST檢索和比對。

結 果

1.64 株結核分枝桿菌臨床分離株的測序結果：64株的23S r RNA測序A2058突變結果見表1，1株為陽性。另外，1株H37Rv標準株測序結果沒有A2058位點的突變。

2.結果：經過兩組引物的PCR擴增、測序，標準株H37Rv 1株測序顯示沒有A2058突變，64株臨床分離株中，在同一株廣泛耐藥菌株經過兩組引物的PCR擴增，測序均顯示在同一位點A2058，有原來的腺嘌呤A改變為鳥嘌呤G的突變，其他臨床分離株均沒有突變。在耐克拉霉素的結核分枝桿菌臨床分離株中僅占2.56%（1/39），在廣泛耐藥菌株中占1/10。

討 論

在治療結核病的藥物中，可以選用的有效藥物不多，只有15種［1］，特別是耐藥結核病，而耐多藥和廣泛耐藥結核病可選擇的藥物更少。在小鼠試驗中發現，克拉霉素對多種分枝桿菌在MIC為4～16 mg/L時，作用顯著強于紅霉素，稍弱于氟喹諾酮類藥物，可適當提高利福平對 H37Rv菌株的活性，但不能提高利福平和異煙肼對其他分枝桿菌的作用，在巨噬細胞內克拉霉素對結核分枝桿菌呈現高度活性，與利福平合用對耐利福平和異煙肼的菌株有協同作用［7］。在我院的體外藥敏試驗中，顯示克拉霉素往往對耐多藥和廣泛耐藥結核分枝桿菌臨床分離株有效，當然也有部分顯示耐藥的。

目前，在其他細菌中，如大腸埃希菌、龜膿腫分枝桿菌、偶發分枝桿菌、鳥-胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等產生對大環內酯類藥物耐藥的機理中，重點集中在23S rRNA中出現A2058位點的突變，主要是在A2058位點的腺嘌呤A改變為鳥嘌呤G的突變，對結核分枝桿菌23S rRNA中A2058位點突變檢測未見報道［8-12］。本研究通過對結核分枝桿菌臨床分離株的檢測，發現在對克拉霉素敏感的臨床分離株中都沒有在23S rRNA中出現A2058位點的突變；而在對克拉霉素耐藥的臨床分離株中，僅1株廣泛耐藥臨床分離株在23S r RNA中出現A2058位點的突變（占2.56%），在廣泛耐藥臨床分離株中占1/10。在其他細菌中，A2058位點的突變為克拉霉素產生耐藥的重要機制，但本研究結果表明，結核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制中，A2058突變可能不是結核分枝桿菌產生對克拉霉素耐藥的主要機制。結核分枝桿菌產生對克拉霉素耐藥的機制有待進一步研究。

表1 64株結核分枝桿菌臨床分離株23S rRNA A2058突變測序結果（株）

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［2］Vester B，Douthwaite S.Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（1）：1-12.

［3］中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006：8-68.

［4］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Susceptibility testing mycobacteria，nocardia，and other aerobic actinomycetes：approved standard.Wayne（USA）：National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.

［5］Richter E，Rüsch-Gerdes S，Hillemann D.First linezolid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（4）：1534-1536.

［6］Jamal MA，Maeda S，Nakata N，et al.Molecular basis of clarithromycin-resistance in Mycobacterium avium intracellulare complex.Tuber Lung Dis，2000，80（1）：1-4.

［7］程書權，孔淑敏.大環內酯類抗生素在某些細菌感染治療中的應用現狀.世界臨床藥物，2005，26（11）：670-674.

［8］Siqmund CD，Ettayebi M，Morqan EA，et al.Antibiotic resistance mutations in 16S and 23S ribosomal RNA genes of Escherichia coli.Nucleic Acids Res，1984，12（11）：4653-4663.

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［12］Burman WJ，Stone BL，Brown BA，et al.AIDS-related Mycobacterium lansasii infection with initial resistance to clarithromycin.Diagn Microbiol Infect Dis，1998，31（2）：369-371.

（本文編輯：郭萌）

·通 知 ·

我國第一部《中國防癆史》已由人民衛生出版社出版

2009年4月，中華人民共和國衛生部疾病預防控制局委托中國防癆協會負責組織編寫《中國防癆史》。經過3年多的努力，我國第一部《中國防癆史》的編撰工作全部完成，于2013年3月由人民衛生出版社出版。

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銀行匯款：戶名：中國防癆協會；開戶行：工行北京崇文支行永定門分理處；賬號：0200001509217905165。

（中國防癆協會秘書處）

Analyses of 23S r RNAs of 39 clarithomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

KUANG Xiao-jia，TAN Shou-yong，WU Bi-tong，CAI Xing-shan，ZHANG Yuan-liang. Four Department of Internal Medicine，the Chest Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510095，China

KUANG Xiao-jia，Email：judy83573615@126.com

Objective To investigate the changes of 23S rRNA at site 2058 of clarithromycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.Methods One Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain and 64 isolates were detected，in which 39 clarithromycin-resistant isolates，25 clarithromycin-sensitive isolates.The 23S rRNAs of Mycobacterium tuberculosis isolates were analyzed by polymerase chain reaction（PCR）and sequencing. Results The 23S rRNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain did not found the mutation at site 2058.Of 64 Mycobacterium tuberculosis isolates，only 1 extensively drug-resistant（XDR）strain had A2058A-G mutation of 23S r RNA，which account 2.56%（1/39）clarithromycin-resistant strains and 1/10 XDR strains.Conclusion The mutation of 23S rRNA at site 2058 of Mycobacterium tuberculosis may not be the main cause inducing its clarithromycin resistance.The mechanism of Mycobacterium tuberculosis clarithromycin resistance need be further studied.

Mycobacterium tuberculosis； Clarithromycin； RNA，ribosomal，23S； Drug resistance，bacterial

2013-05-23）

510095廣州市胸科醫院內四科

鄺小佳，Email：judy83573615@126.com