三陰乳腺癌中Notch1 和Wnt1 的表達及其臨床意義

王 蕾，李燕輝，吳士茜，尹曉玲，牛麗輝，秦景云

雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone reeeptor，PR)和人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER －2)均是陰性的乳腺癌，稱為三陰乳腺癌(triple negative breast cancer，INBC)，是最近幾年被提出來的一種乳腺癌亞型。此類乳腺癌具有侵襲力強、復發早、遠處轉移風險高和預后差等特點。由于目前對于此種類型的乳腺癌無針對性治療指南，化療是惟一的治療方法，但是整體療效不理想。本研究擬用免疫組織化學SP 法檢測三陰乳腺癌組織中Notch1、Wnt1 的表達情況，旨在進一步了解癌基因蛋白與三陰乳腺癌預后的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008—2011 年在河北工程大學附屬醫院手術治療并獲得明確病理診斷，且免疫組織化學檢測ER、PR和Her－2 均為陰性的56 例乳腺癌患者作為研究對象，均為女性，年齡28 ～75 歲，中位年齡46 歲，患者術前未進行任何治療。所有手術標本統一重新切片HE 染色確定病理診斷，臨床病理資料齊全。56 例乳腺癌患者中39 例伴淋巴結轉移;其中浸潤性導管癌導管內癌33 例，浸潤性小葉癌23 例。參照Elston等［1］方法并進行改良，對56 例乳腺癌進行分級:Ⅰ級15 例，Ⅱ級20 例，Ⅲ級21 例。按照第6 版AJCC 分期:Ⅰ期8 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期22 例，Ⅳ期19 例。標本常規取材，10%甲醛固定，石蠟切片(4μm)，常規HE 染色。選擇同期30 例患者的癌旁正常組織作為對照組。

1.2 方法 兔抗人Notch1 抗體和兔抗人Wnt1 抗體，即用型SP 試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化染色SP 法。微波抗原修復，免疫組化染色過程按試劑盒說明操作，蘇木精襯染。

1.3 結果判定 用已知陽性的胃癌組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察，Notch1 陽性表達主要定位于細胞質和細胞核，部分定位為細胞膜，Wnt1 陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色顆粒。計數1000 個腫瘤細胞，陽性細胞數＜5%為(－)，≥5%且＜25%為(+)，≥25%且＜50%為(+ +)，≥50%為(+ + +)。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，并采用Spearman 進行等級相關分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Notch1、Wnt1 在三陰乳腺癌組織和正常組織中的表達 Notch1 在三陰乳腺癌組織中的陽性表達率為62.5% (35/56)，在正常組織中的陽性表達率為3.3% (1/30);Wnt1 在三陰乳腺癌組織中的陽性表達率為53.6% (30/56)，在正常組織中的陽性表達率為3.3% (1/30)。兩者在三陰乳腺癌組織中的陽性表達率分別與正常組織比較，差異均有統計學意義(P ＜0.05)。

2.2 兩種蛋白在三陰乳腺癌組織中的表達與臨床病理指標的關系 Notch1、Wnt1 在三陰乳腺癌組織的表達中，腫瘤的大小、病理分級、cTNM 和淋巴結轉移情況比較，差異均有統計學意義(P ＜0.05，見表1)。

2.3 三陰乳腺癌中兩種蛋白分子表達的關系 Spearman 等級相關性分析結果表明:Notch1 與Wnt1 的表達呈正相關(r =0.671，P=0.000)。

表1 Notch1、Wnt1 的表達與臨床病理指標的關系(例)Table 1 Relationship of Notch1，Wnt1 expression and clinical pathological parameters

3 討論

Notch 是基因編碼一類大的跨膜Notch 受體，在哺乳動物中Notch 受體有4 種:Notch1 ～Notch4。這些受體有5 個配體，Delta 樣分子1、3、4 以及Jagged 1、2。一個完整的Notch 信號通路包括:Notch 受體、配體、CSLDNA 結合蛋白(CBF－1/RBP－Jκ、Hairless 抑制基因和Lag－1 的合稱)以及其他效應物等構成［2］。有研究發現，Notch 信號不僅影響細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和上皮細胞－間葉細胞轉化，并且在胚胎發育、血管生成、某些神經系統疾病及腫瘤形成等過程中起著重要的作用［3］。

在許多人類腫瘤中如:宮頸癌、結腸癌、腎細胞癌等可有Notch 信號表達異常。在人類惡性腫瘤中，Notch1 作用可以是抑癌基因或是癌基因，其機制是:(1)Notch 信號通路是其他細胞信號通路的交點，許多不同的刺激可激活Notch 通路;(2)Notch 的配體和靶基因不同，在不同組織、腫瘤發展的不同階段，其作用也可能是不同的;(3)Ras 和Wnt 通路通過激活Notch 途徑調節細胞生長［4］。在人類乳腺癌中Notch1 更多的是起到癌基因的作用，在乳腺癌細胞系可見Notch1 和Notch4 的激活形式。Dontu 等［5］認為，Notch1 的激活可以使乳腺干細胞自我更新。在三陰乳腺癌中，高表達的Notch1 可降低患者術后5 年生存率，敲除Notch1 基因可以提高患者對化療的敏感性。本研究也發現，三陰乳腺癌組中Notch1 的表達明顯高于正常乳腺組織，并且隨著病理分級增高其表達也隨之增強。此外，Notch1 表達與腫瘤大小、臨床分期有關。

Wnt1 也叫int－1，在鼠乳腺癌病毒誘導的乳腺癌中，無翅有關的鼠乳腺腫瘤病毒整合位點1 作為原癌基因發現的。Wnt 糖蛋白通過結合到卷曲蛋白－低密度脂蛋白受體相關蛋白(frizzled－low density lipoprotein receptor －related protein，Frizzled－LRP)5/6 復合物來調節內穩態和發育。Wnt 信號途徑包括經典的Wnt 信號途徑和非經典的Wnt 信號途徑，兩者形成負反饋環路。研究認為，經典通路與腫瘤的發生發展關系密切，有許多腫瘤包括頭頸部腫瘤、食管癌、胃癌、白血病、基底細胞癌等中都有Wnt1 的異常表達［6］。其致癌機制是:Wnt蛋白作用于細胞膜上的受體，信號傳入細胞后，糖原合成酶激酶－3β (glycogen synthase kinase －3β，GSK －3β)被Wnt 信號抑制，導致β 連環蛋白(β－catenin)的降解被中斷，細胞質內游離的β－catenin 含量增加，異位進入細胞核，作用于T細胞因子/淋巴樣增強因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCG/LEF)，形成轉錄復合物，激活Wnt 信號途徑中的靶基因，調控細胞的生長、分化和凋亡［7］。在Wnt1 轉基因鼠的腫瘤模型中，Wnt1 信號的激活與乳腺癌進展密切相關，Wnt1 小干擾RNA (small interference，sRNA)或抗Wnt1 抗體誘導細胞凋亡，抑制腫瘤生長。本研究發現，三陰乳腺癌組織中Wnt1 的陽性表達與組織分級、病理分期和淋巴結轉移有關，與腫瘤的大小和患者的年齡無關。Wnt1 在三陰乳腺癌的陽性表達明顯高于癌旁正常組織。

研究發現Wnt 和Notch 信號通路有交互作用 (cross －talk)，Wnt 蛋白通過與Notch 受體結合調控下游基因的表達，在乳腺癌形成過程中起協同作用。果蠅翅細胞中，Wnt 信號通過減輕Notch 的作用來促進G1 － S 期進展。我們對Notch1、Wnt1 在三陰乳腺癌組織中陽性表達進行相關性研究，發現二者呈正性相關。

總之，Notch1、Wnt1 在三陰性乳腺癌的發生、發展過程中存在一種相輔相成的作用，協同作用下促進腫瘤的發生，兩者的聯合檢測有助臨床對TNBC 的研究，具有一定現實意義。

1 Elston CW，Ellis IO． Pathological prognostic factors in breast cancer．I． The value of histological grade in breast cancer:experience from a large study with long － term follow － up ［J］． Histopathology，2002，41 (3A):154 －161．

2 Wang J，Fu L，Gu F，et al． Notch1 is involved in migration and invasion of human breast cancer cells ［J］． Oncol Rep，2011，26 (5):1295 －1303．

3 Leong KG，Karsan A． Recent insights into the role of Notch signaling in tumorigenesis ［J］． Blood，2006，107 (6):2223 －2233．

4 Qi R，An H，YuY，et al． Notchl signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma through induction of cell cycle arrest and apoptosis ［J］． Cancer Res，2003，63 (23):8323 －8329．

5 Dontu G，El － Ashry D，Wicha MS． Breast cancer，stem/progenitor cells and the estrogen receptor ［J］． Trends Endocrinol Metab，2004，15 (5):193 －197．

6 Castilho RM，Squarize CH，Chodosh LA，et al． mTOR mediates Wnt－induced epidermal stem cell exhaustion and aging ［J］． Cell Stem，2009，5 (3):232 －234．

7 Duan J，Gherghe C，Liu D，et al． Wnt1/βcatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair［J］． EMBO J，2011，31 (2):429 －442．