羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌表面疏水性及黏附力的影響

范雪平 牛 兵 王倩倩 張 勇

1.河南省口腔醫院牙體牙髓科，河南 鄭州 450052；2.河南省中醫院口腔科，河南 鄭州 450003；3.鄭州人民醫院口腔科，河南 鄭州 450003；4.河南省駐馬店市質量技術監督檢驗測試中心，河南 駐馬店 463000

變形鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公認的口腔主要致齲菌[1]，具有高度黏附于牙面的能力，變鏈菌在牙面上黏附和定植是變鏈菌致齲的始動因子[2]其黏附過程經歷兩個階段后形成菌斑生物膜。第一階段變鏈菌表面蛋白與獲得性膜中宿主因子之間相互作用形成初始黏附，即非蔗糖依賴性黏附。第二階段變鏈菌的葡糖基轉移酶（glueosyltransferase，GTFs）利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖來介導該菌的蔗糖依賴性黏附、集聚。變鏈菌通過黏附定居于牙面，形成致齲性微生態環境牙菌斑，利用糖產酸，導致牙齒脫礦，產生齲病[3]。細菌表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）是細菌非特異性黏附的重要部分，研究表明，細菌表面疏水性在細菌對牙面及口腔上皮細胞的初始黏附中起著重要作用，表面疏水性越強的細菌黏附力越強[4]。目前尋找安全有效的防齲物質是齲病防治研究的重點。羧甲基殼聚糖對諸多口腔細菌均有一定的抑制作用[5]，并具有良好的生物相容性和可降解性，可形成凝膠或膜狀結構，尤其適用于口腔。目前對其在防齲方面的研究主要集中在抑菌方面，而對其防齲機制的研究報道較少。

本研究采用微生物黏著碳氫化合物法（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）[6]， 測定不同濃度的羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌表面疏水性的影響及在玻壁表面的黏附作用，探討其影響變形鏈球菌黏附的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3種羧甲基殼聚糖，平均相對分子質量（MW）分別為5500、10000、12000，脫乙酰度（D.D）均為 90.6%，由青島海匯生物工程有限公司提供；TPY培養基，由北京陸橋技術有限公司提供。十六烷（沃凱），購自國藥集團化學試劑有限公司 （上海）。BHI培養基：OXOID LTD，Basingstoke，Hampshire，England。實驗菌株變形鏈球菌 Streptococcus mutans，S.mutans ATCC 25175，菌株由四川大學口腔生物醫學工程教育部重點實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液調整 將變形鏈球菌ATCC25175凍干菌株復蘇并接種于 BHI固體培養基中，在 37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）厭氧培養48 h，經鑒定后，轉移到含2%蔗糖的BHI液體培養基中，于 37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）條件下厭氧箱培養24 h。以2500 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），收集細菌，PUM緩沖液洗菌3次，每次3 mL。用PUM緩沖液作為空白對照，將紫外可見分光光度計調零，用PUM緩沖液調在660 nm波長處吸光度A=0.5的菌懸液。

1.2.2 實驗分組 實驗分為空白對照組及實驗組。空白對照組的菌體用PUM緩沖液處理（不含羧甲基殼聚糖溶液）3 mL；實驗組分別為含不同分子質量不同濃度的羧甲基殼聚糖的 BHI培養基 3 mL， 濃度分別為：5，2.5，1.25，0.64，0.32，0.16 g/L，共7組。以上實驗組和對照組每組4個平行管，共計84管。

1.2.3 疏水性測定 采用微生物黏著碳氫化合物[6]（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）測定不同濃度的羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌表面疏水性的影響。調整菌懸液的吸光度A=0.5取3 mL加入羧甲基殼聚糖溶液的試管中，混和均勻，再將其放置在水浴箱中，調整水浴箱的溫度為37℃孵育15 min，取 3 mL，加入400 μL十六烷，劇烈震蕩60 s，使各個試管充分混和均勻。然后再靜置15 min，使試管中的羧甲基殼聚糖溶液分為上下兩層，其上層為油層，下層是水層，取油層進行革蘭染色，顯微鏡下觀察細菌；保留水層，用紫外可見分光光度計在660 nm波長處測定各個試管的吸光度A值，每管分別測3次，記錄平均值。細菌表面疏水率=（初始 A660nm－加十六烷后 A660nm）/初始 A660nm×100%。

1.2.4 黏附作用的測定 采用Hattori等[2-7]的研究方法測定其對變形鏈球菌的黏附抑制作用。取84個10 mL玻璃試管，設每組4個平行管，分別加入以上備好的菌液0.1 mL，BHI液體培養基2.1 mL和50%蔗糖-0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液0.25 mL，再分別向各個試管中加入實驗組（分別為含不同分子量不同濃度的羧甲基殼聚糖的BHI培養基3 mL）和對照組（不含羧甲基殼聚糖溶液）溶液0.05 mL，混和均勻，將各個試管與水平面斜行呈300°角放置，37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）的條件下放置于厭氧箱中培養18 h。然后輕輕移去試管中的溶液，將黏附到試管壁的細菌用蒸餾水洗脫，每次3 mL，共計3次，然后以3500 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），收集細菌，再將其置于3 mL蒸餾水中，混勻。用波長為550 nm的紫外可見分光光度計測定A550nm，計算黏附抑制率。羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌的黏附抑制的影響使用黏附抑制率表示。黏附抑制率=（對照組A550nm－實驗組 A550nm）/對照組 A550nm×100%

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，各樣本組間均數之間的比較采用SNK檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌ATCC 25175表面疏水性的影響

結果見表1，不同分子質量羧甲基殼聚糖隨著其濃度的增加其疏水率逐漸降低。經統計學分析：同一分子質量，濃度不同各組羧甲基殼聚糖與對照組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結果顯示：分子量為5500的羧甲基殼聚糖濃度為1.25、2.5、5.0 g/L組間差異有統計學意義（P＜0.05）；0.64、0.32、0.16 g/L 時，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；分子量為10000的羧甲基殼聚糖濃度為 0.64、1.25、2.5、5.0 g/L 組間差異有統計學意義 （P ＜0.05）；0.32 g/L與0.16 g/L時組間差異無統計學意義 （P＞0.05）；分子量為12000的羧甲基殼聚糖，5 g/L與2.5 g/L，0.64 g/L、0.32 g/L、0.16 g/L之間組間比較差異均無統計學意義（P ＞ 0.05）。

表1 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖培養后變鏈菌表面疏水率的比較（100%，n=4，）

表1 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖培養后變鏈菌表面疏水率的比較（100%，n=4，）

分組 稀釋度（g/L）分子質量5500 10000 12000實驗組5空白組F值P值2.51.250.640.320.1600.096±0.0140.113±0.0200.152±0.0230.247±0.0120.268±0.0150.293±0.0100.535±0.016280.8160.0000.099±0.0140.117±0.0160.154±0.0130.250±0.0150.274±0.0150.288±0.0180.535±0.016380.7740.0000.116±0.0150.136±0.0240.172±0.0200.260±0.0230.281±0.0200.301±0.0190.535±0.016189.0630.000

2.2 羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌培養后菌液吸光度值的影響

結果見表2，隨著羧甲基殼聚糖溶液濃度的升高，其黏附吸光度值逐漸降低。經統計學檢驗，分子質量相同，濃度不同的各實驗組與對照組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結果顯示：當分子量為5500及10000時，0.32 g/L與0.16g/L兩濃度組間比較差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；當分子量為 12000時，0.64、0.32、0.16 g/L 濃度組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖培養后對變形鏈球菌菌液吸光度值的影響（n=4，）

表2 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖培養后對變形鏈球菌菌液吸光度值的影響（n=4，）

分組 濃度（g/L）分子量5500 10000 12000實驗組5空白組F值P值2.51.250.640.320.1600.097±0.0110.135±0.0090.169±0.0060.191±0.0100.212±0.0080.222±0.0050.255±0.005173.1860.0000.103±0.0060.144±0.0060.174±0.0070.199±0.0070.218±0.0070.223±0.0070.255±0.005266.4510.0000.147±0.0050.175±0.0050.200±0.0050.217±0.0060.225±0.0070.228±0.0070.255±0.005163.9050.000

2.3 羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌黏附抑制的影響

結果見表3，不同分子質量羧甲基殼聚糖隨著其濃度的增加其黏附抑制率也隨之降低。經統計學分析，分子質量相同，濃度不同的各組黏附抑制值總體均數間具有顯著性差異（P＜0.05）。兩兩比較結果顯示：分子質量為5500及10000時，0.32 g/L與0.16 g/L兩個濃度組間比較無統計學差異。分子量為12000時，0.64 g/L、0.32 g/L與0.16 g/L濃度組間比較無統計學差異（P＞0.05），其他各濃度組間黏附抑制值均有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖對變鏈菌黏附抑制率的影響（100%，n=4，）

表3 不同分子質量、濃度羧甲基殼聚糖對變鏈菌黏附抑制率的影響（100%，n=4，）

稀釋度（g/L） 分子質量5500 10000 1200052.51.250.640.320.16 F值P值0.620±0.0440.463±0.0250.337±0.0240.250±0.0410.169±0.0330.128±0.021132.1210.0000.596±0.0230.437±0.0240.330±0.0260.231±0.0340.146±0.0250.125±0.027184.6580.0000.425±0.0180.313±0.0200.216±0.0210.148±0.0220.119±0.0260.107±0.027163.9050.000

3 討論

3.1 殼聚糖/羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌的疏水性作用的影響

目前研究認為，蔗糖非依賴性黏附主要是通過疏水作用、鈣橋靜電、氫鍵等非特異性黏附和細菌表面粘結素與獲得性膜受體之間的特異性黏附。疏水性是指非極性溶液在極性水中所呈現的一種不穩定狀態，并由此引發的一系列熱能和分子重新分布及排列的變化[8]。CSH被認為是影響細菌一宿主反應的因素之一，其強弱與蔗糖非依賴性黏附密切相關[9]。近期的研究發現，疏水性的強弱與細菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、莢膜等結構有關。細菌表面的疏水蛋白與獲得性膜中的疏水基團結合，表面疏水蛋白愈多其疏水性愈強，細菌黏附力也愈強[10]。

MATH是根據細菌在各種碳氫化合物中經過簡短期的混合，下層水相吸收能力減少，從而導致細菌對碳氫化合物黏附的程度不同，通過測定水相的吸光度，可確定細菌表面疏水性的大小[11]。本實驗即采用該方法研究羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌疏水性的影響。結果表明：不同分子量的羧甲基殼聚糖溶液，濃度為0.16 g/L時作用于變形鏈球菌細胞表面，其表面疏水性明顯降低，與空白對照組之間有顯著性差異。本實驗表明：濃度為0.16 g/L羧甲基殼聚糖溶液可以通過表面疏水性明顯降低來抑制變形鏈球菌的黏附作用。它的作用機制是疏水作用、鈣橋靜電、氫鍵等非特異性黏附和細菌表面粘結素與獲得性膜受體之間的特異性黏附，還是通過其他方式，需要進一步進行機制的研究。

3.2 殼聚糖/羧甲基殼聚糖對變形鏈球菌的黏附作用的影響

黏附在牙齒齲病發生中起重要作用，而變形鏈球菌對牙面有高度的黏附作用。殼聚糖及其衍生物對變形鏈球菌黏附抑制作用已有少量報道。

Tarsi等[12]報道低分子量殼聚糖能選擇性阻止變形鏈球菌在羥基磷灰石表面的黏附及促進已黏附的變形鏈球菌的解脫。Virga等[13]研究證實，高分子殼聚糖當濃度為0.5%時即可對變形鏈球菌產生特異性的解脫黏附作用。有研究指出[10]，殼聚糖可抑制變形鏈球菌對毛細管的黏附，并促進附著于黏附板上的變形鏈球菌脫落，0.5%濃度的殼聚糖作用強于0.25%。

本研究與上述報道相似，結果表明，不同分子量的羧甲基殼聚糖可降低變形鏈球菌表面的疏水性，并抑制變形鏈球菌在光滑玻壁表面的黏附能力；當濃度為0.16 g/L時作用于變形鏈球菌培養后，其菌液吸光度值與對照組相比具有顯著性差異。羧甲基殼聚糖能夠有效降低口腔內變形鏈球菌的黏附，從而減少其在菌斑中的數量，在臨床上可以通過羧甲基殼聚糖的這一特性達到防治齲病的目的。但其作用機制復雜，是否存在對黏附作用抑制的另外機制，既蔗糖依賴性黏附有抑制作用，還需要進一步深入研究。

[1]樊明文.齲病病因與免疫預防[J].中國實用口腔科雜志，2008，1（10）：583-586.

[2]程睿波，陳旭，劉淑杰，等，白屈菜紅堿對變形鏈球菌葡糖基轉移酶和細胞外水不溶性多糖的影響[J].上海口腔醫學，2007，16（1）：68-72.

[3]Loesche WJ.Role of Streptococcus mutans in human dental decay[J].Microbiol Rev，1986，50（4）：353.

[4]Colloca ME，Ahumada MC，Lopez ME，et al.Surface properties of lactobacilli isolated from healthy subjects[J].Oral Dis，2000，6（4）：227-233.

[5]唐濤，薛毅，信玉華，等.羧甲基殼聚糖復合奧硝唑后對口腔重要厭氧菌增效抑菌作用的評價[J].實用口腔醫學雜志，2007，23（3）：451.

[6]Drozd C，Schwartzbrod J.Hydrophobic and electrostatic cell surface properties of Cryptosporidium parvum[J].Appl Environ Microbiol，1996，62（4）：1227-1232.

[7]Hattori M，Hada S，Watahiki A，et al.Studies on dental caries prevention by traditional medicines.X.Antibacterial action of phenolic components from Mace against Streptococcus mutans[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），1986，34（9）：3885-3893.

[8]侯幼紅，吳紹熙.微生物細胞表面疏水性與黏附性的研究進展[J].國外醫學：皮膚性病學分冊，1995，21（2）：83-86.

[9]Wassall MA，Embery G，Bagg J.The role of hydrophobicity in Streptococcus sanguis and streptococcus salivarius adhesion to salivary fraction-coated hydroxyapat-ite[J].Colloids Surf B：Biointerfaces，1995，5：143-152.

[10]周學東.口腔生物化學[M].成都：四川大學出版社，2002：199-205.

[11]Busscher HJ，Van de Belt-Gritter B，Van der Mei HC，et al.Implications of microbial adhesion to hydrocarbons for evaluating cell surface hydrophobicity2.Adhesion mechanisms[J].Colloids Surf B：Biointerfaces，1995，5：l11-l16.

[12]Tarsi R，Corbin B，Pruzzo C，et al.Effect of low molecular weight chitosans on the adhesive properties of oral streptococci[J].Oral Microbiol Immunol，1998，13（4）：217-224.

[13]Virga C，Landa C，Beltramo D，et al.Low and high molecular weight chitosans interactions with Streptococcus mutans：an in vitro study[J].Acta Odontol Latinoam，2003，16（1-2）：9-16.