NaCl脅迫下鮮煙葉中多酚物質含量及PAL和PPO活性變化

胡慶輝，王程棟，王樹聲*，李湘偉，侯 娜，王浩浩，李 斌

（1.農業部煙草類作物質量控制重點開放實驗室，中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

多酚物質是烤煙中重要的香氣前體物，煙葉中某些酚類物質的含量與煙葉品質及其芬香吸味成正相關，與煙葉等級密切聯系，常被作為優質煙化學成分考核指標之一[1]。煙葉中的酚類化合物主要包括單寧類、香豆素類、黃酮類、花色素類、簡單酚衍生物等，其中綠原酸、蕓香苷和莨菪亭是煙草中最主要的酚類物質[2]。有關研究表明，煙葉中多酚類物質的含量受眾多栽培環境條件的影響，如季學軍等[3]報道，皖南地區粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土植煙中部葉多酚含量高于水稻黏土；趙銘欽等[4]認為，培土成壟和分次施鉀可以明顯增加煙葉中總酚、綠原酸、蕓香苷、石油醚提取物含量；王毅等[5]研究發現，在一定范圍內增加 UV-B輻射強度，煙草總多酚含量變化不大，但輻射強度過高可提高煙葉總多酚含量。鹽脅迫是目前對農業生產影響較大的非生物脅迫因子之一，目前有關 NaCl脅迫對烤煙栽培品種多酚物質含量影響的報道較少。本研究試圖探討分析NaCl脅迫下煙草多酚物質及相關酶活性的變化規律，為研究逆境脅迫下的多酚物質的調控機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為NC89。溫室播種育苗，幼苗3片真葉假植，五葉一心時進行砂培盆栽，每盆裝填石英砂15 kg，定期澆Hoagland營養液，植株生長至中心花開放期打頂，打頂后8 d，進行NaCl脅迫處理。

脅迫處理在1/3 Hoagland營養液中設350、700和0mmol/L（CK）3個NaCl處理濃度，3次重復。

脅迫處理后 0、2、4、6、8 d，分別取植株下部葉片（從下至上第 4片），剪取葉片中部不含明顯葉脈的葉肉樣品，置于CHRIST冷凍干燥機干燥。

1.2 測定方法

多酚氧化酶（PPO）活性測定參照文獻[6]的方法，測定波長為525 nm；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照陳毓荃方法[7]；綠原酸、蕓香苷含量測定參照文獻[8]；類黃酮和花青苷含量測定采用Pirie[9]和王惠聰[10]的方法，以 U=OD600nm-OD553nm表示花青苷含量。

1.3 數據分析

采用DPS 7.05軟件進行相關性分析。

2 結 果

2.1 NaCl脅迫下烤煙葉片綠原酸含量變化

由圖1看出，NaCl脅迫處理前4 d，綠原酸含量與對照差異不明顯，處理4 d后，含量開始增加，處理8 d時，達到最大值，平均比對照高25.60%。不同 NaCl濃度脅迫下，隨處理時間的延長，葉片綠原酸含量變化趨勢相似，其中脅迫處理6 d時含量接近，脅迫8 d時350mmol/L處理煙葉綠原酸含量明顯高于700mmol/L。由此表明，烤煙新鮮葉片中綠原酸含量隨 NaCl脅迫時間的延長，在脅迫后期逐漸增加，以350mmol/L處理增幅較大。

圖1 NaCl脅迫下鮮煙葉綠原酸含量變化Fig.1 Changes of chlorogenic acid contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.2 NaCl脅迫下烤煙葉片蕓香苷含量變化

由圖2看出，350mmol/L NaCl處理下，葉片蕓香苷含量在脅迫后2 d略增加，處理4、6 d含量與對照接近，脅迫8 d時含量明顯上升，比對照增加12.02%。與對照相比，700mmol/L處理下蕓香苷含量在脅迫前期略低，后期略高，但差異都不明顯。可以看出，不同 NaCl濃度脅迫下，葉片蕓香苷含量變化趨勢有較大差異，350mmol/L處理蕓香苷含量在脅迫后期增加，而700mmol/L處理蕓香苷變化不大。

圖2 NaCl脅迫下新鮮煙葉蕓香苷含量的變化Fig.2 Changes of rutin contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫下烤煙葉片類黃酮含量變化

由圖3看出，350mmol/L脅迫處理2 d時類黃酮含量迅速上升，比對照增加16.67%，4、6 d時含量回落，與對照差異不顯著，處理8 d含量快速上升，比對照高33.54%。700mmol/L脅迫處理類黃酮含量呈先略降低再平緩增加。不同 NaCl濃度脅迫下，葉片類黃酮含量變化差異較大，脅迫2、8 d時，350mmol/L處理類黃酮含量均明顯高于 700mmol/L。NaCl脅迫的濃度及時間都對類黃酮含量變化有明顯影響，其中350mmol/L脅迫處理類黃酮含量隨處理時間延長呈“增加-降低-增加”的變化趨勢。

圖3 NaCl脅迫下新鮮煙葉類黃酮含量變化Fig.3 Changes of flavonoid contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.4 NaCl脅迫下烤煙葉片花青苷含量變化

由圖4看出，對照條件下，葉片花青苷含量緩慢增加。處理2 d時，350mmol/L NaCl處理花青苷含量明顯增加，高于對照28.95%，700mmol/L處理花青苷含量下降。隨后350、700mmol/L脅迫處理含量變化趨勢相似，均隨處理時間延長，先緩慢降低，再迅速下降，700mmol/L處理6 d時比對照降低80.83%，350mmol/L處理8 d時花青苷含量也大幅下降。不同NaCl濃度脅迫下，350mmol/L脅迫花青苷含量均明顯高于700mmol/L處理。

2.5 NaCl脅迫下烤煙葉片PAL活性變化

圖4 NaCl脅迫下新鮮煙葉花青苷含量變化Fig.4 Change of anthocyanin contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

圖5 NaCl脅迫下鮮煙葉苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化Fig.5 Changes of phenylalanine ammonia lyase (PAL)activity of fresh tobacco leaves under NaCl stress

由圖5可知，350mmol/L NaCl脅迫下葉片PAL活性隨處理時間的延長而逐漸增加，其中處理 8 d時增幅最大，活性是對照的2.44倍，處理2 d時增幅次之。700mmol/L脅迫下PAL活性先降低，脅迫4 d時活性降幅最大，比對照下降42.95%，隨后逐漸上升，但均低于對照。可見，NaCl脅迫濃度對PAL活性變化有明顯影響，350mmol/L NaCl脅迫后PAL活性明顯高于700mmol/L NaCl脅迫，其中處理8 d時兩者活性差異最大。

2.6 NaCl脅迫下烤煙葉片PPO活性變化

NaCl脅迫下新鮮煙葉多酚氧化酶（PPO）活性變化如圖6。在對照條件下，PPO活性先一定幅度下降，再平穩增加，最后與處理前接近。350、700mmol/L NaCl脅迫下PPO活性變化趨勢一致，分別隨脅迫時間的延長而增加，脅迫2 d時增幅最大，隨后增幅逐漸減小。350mmol/L NaCl脅迫在處理前4 d活性略高于700mmol/L，4 d后兩者接近。

2.7 NaCl脅迫下多酚物質與PAL、PPO相關性分析

從表1可知，350mmol/L NaCl脅迫處理后，PAL活性與綠原酸在0.01水平上極顯著正相關，相關系數0.95，與蕓香苷在0.05水平上顯著正相關，相關系數0.82，700mmol/L NaCl脅迫處理下，PAL活性與綠原酸、蕓香苷相關系數減小。PPO活性與綠原酸在350、700mmol/L NaCl脅迫下呈正相關關系，接近顯著水平，與類黃酮、蕓香苷含量的關系不明確，與花青苷在700mmol/L NaCl脅迫處理下顯著負相關，相關系數-0.84。

圖6 NaCl脅迫下新鮮煙葉多酚氧化酶（PPO）活性變化Fig.6 Changes of polyphenol oxidase (PPO) activity of fresh tobacco leaves under NaCl stress

表1 多酚物質含量與PAL、PPO活性相關系數Table 1 Correlations between polyphenols contents and PAL,PPO activities

3 討 論

多酚是一類廣泛存在于植物體內的次生代謝物，被認為是植物抵抗不良環境因素的物質之一。Kasai等[11]研究了多種植物的抗氧化機理，認為綠原酸可抑制DNA受到活性氧攻擊時8-OH-dG的形成。Koeppe等[12]發現低溫可促進綠原酸含量的增加。本研究發現，NaCl脅迫后期綠原酸含量增加，以700mmol/L NaCl脅迫增幅較小，可能因為嚴重的脅迫會將綠原酸氧化形成其他物質[13]。

蕓香苷是烤煙類黃酮中含量較大的物質之一，NaCl脅迫處理下蕓香苷、類黃酮含量變化趨勢相似。蔡娜等[14]認為，干旱脅迫可以增加蕎麥總黃酮和蘆丁含量。類黃酮含量受脅迫程度的明顯影響，350mmol/L NaCl脅迫2 d時，含量增加，之后含量下降，NaCl處理濃度增大時，類黃酮含量則明顯降低，與前人研究 NaCl脅迫紫葉李葉片的研究結果一致[15]。董新純等[16]也報道，增強UV-B處理后苦蕎葉片類黃酮含量與逆境傷害程度相關。350mmol/L NaCl脅迫8 d時，蕓香苷、類黃酮含量明顯增加，可能與其合成過程中的關鍵酶PAL活性大幅提高有關。

鹽脅迫可誘導擬南芥突變體花青苷積累，提高植株清除活性氧及抵御逆境的能力[17]，同時紫外光輻射、低溫和干旱脅迫也可增加花青苷含量，抵御環境脅迫[18]。本研究中350mmol/L NaCl脅迫前2 d，花青苷快速增加，之后積累量不斷下降，700mmol/L NaCl處理時花青苷含量持續降低。花青苷是由花青素和糖組成的糖苷，胡曉麗[15]認為，花青苷含量的下降是受到可溶性糖降低的影響。

PAL作為苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶，在土壤干旱脅迫下與紫葉矮櫻葉片類黃酮正相關極顯著，PAL活性提高能促進類黃酮的合成[19]。350mmol/L NaCl脅迫條件下，PAL活性上升，與綠原酸、蕓香苷的相關性分別達到極顯著、顯著，但700mmol/L NaCl脅迫下，這種相關關系明顯減弱。這說明該NaCl脅迫下PAL活性的增加促進綠原酸、蕓香苷的合成，但過高濃度 NaCl脅迫時綠原酸、蕓香苷的積累主要受其他酶或氧化傷害的影響。

PPO可在烘烤過程中氧化多酚物質形成醌，但在非生物脅迫中與多酚的關系報道較少。NaCl脅迫下，PPO活性逐漸上升，與綠原酸呈一定的正相關，但與類黃酮、蕓香苷關系不明確，說明 NaCl脅迫條件下綠原酸的積累除了受其合成機制的影響，還與PPO活性有關。

4 結 論

350mmol/L NaCl脅迫處理可明顯的增加烤煙葉片中多酚物質（類黃酮、蕓香苷、花青苷、綠原酸）含量及PAL活性，但700mmol/L NaCl脅迫時除綠原酸在處理6 d開始小幅增加外，類黃酮、花青苷含量及PAL活性均明顯下降，可見多酚物質含量及PAL活性的變化在不同濃度NaCl脅迫下有較大差異。PAL活性與多酚物質含量的相關性也受脅迫濃度的影響，350mmol/L處理時PAL活性分別與綠原酸、蕓香苷含量呈極顯著、顯著正相關，這說明其與多酚物質含量變化有密切聯系，但此相關性在700mmol/L脅迫時明顯減弱。NaCl脅迫處理下，PPO活性逐漸升高，對綠原酸含量變化有一定影響。從以上結果來看，探討 NaCl脅迫下多酚物質含量及相關酶活性的變化，也可作為一種研究酚類物質調控的方法。

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