兩株煙草根際拮抗菌的生防和促生效果研究

吳秉奇，梁永江，丁延芹，陳曉明，王玉軍，徐 崢，杜秉海*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東 泰安 271018；2.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義 563000；3.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東 泰安 271018）

煙草黑脛病（Phytophthora parasitica var.nicotianae）是我國發(fā)生最為嚴重的煙草土傳病害之一，其造成的年均損失約為12 303.38 萬元，僅次于病毒病[1-2]。目前我國主要采用甲霜靈等化學農(nóng)藥來防治，但是長期使用化學農(nóng)藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導致防治效果下降[3]。此外，長期、反復和大量使用化學農(nóng)藥可引起土壤、水體和大氣的污染，同時也殺傷了其他有益微生物、昆蟲和畜禽，破壞了生態(tài)平衡[4]。采用抗病育種又存在時間長、抗源少等問題，抗病性與品質(zhì)之間往往存在矛盾[5]。因此，生物防治越來越受到人們的重視，其中利用細菌特別是植物根際促生細菌（PGPR）防治土傳病害成為生物防治的重要研究領(lǐng)域[6-7]。20世紀80年代以來，隨著對PGPR的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可以誘導植物系統(tǒng)抗性（ISR），成為生物防治新一輪的研究熱點[8]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有防治煙草黑脛病作用的根際細菌，例如地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）GP13[9]，多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）C-5等[10]，但是大多數(shù)的報道局限于生防菌的防病效果及對病原菌的拮抗作用，PGPR誘導煙草系統(tǒng)抗性及對煙草生理指標的影響等方面的研究仍少見報道，煙草在種植過程中易受到多種細菌、真菌、病毒等病害的侵染，因此，PGPR誘導系統(tǒng)抗性使煙草具有對多種病害的抵抗能力在煙草生產(chǎn)中具有十分重要的意義。

筆者研究兩株煙草黑脛病拮抗菌多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573、YC0136的防病和促生效果，并且通過測定煙草抗性相關(guān)生理指標來探討其對煙株系統(tǒng)抗性的誘導作用，為生防菌在煙草田間的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 盆栽土壤 試驗用土壤取自泰安當?shù)剞r(nóng)田，每盆裝土大約 10 kg，土壤理化性質(zhì)為全氮 6.41 g/kg，全磷1.13 g/kg，全鉀7.20 g/kg，有機質(zhì)9.89 mg/g，腐殖質(zhì)2.42 mg/g，速效磷93.23 mg/kg，速效鉀86.23 mg/kg，銨態(tài)氮6.58 mg/kg，硝態(tài)氮62.74 mg/kg，pH 7.31。

1.1.2 肥料與藥劑 美康田佳牌復合肥（山東康田化肥有限公司），總有效成分≥40%，其中m(N):m(P2O5):m(K2O)=20:10:10，按照5 g/盆用量溶解后澆灌于土壤中。58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑（江蘇寶靈化工有限公司）。

1.1.3 煙草 煙草品種為 K326，在育苗基質(zhì)中培育至5～6片真葉，備用。

1.1.4 供試菌種 分離自貴州煙田根際土壤的兩株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573和YC0136，平板對峙實驗中對煙草寄生疫霉（Phytophthora nicotianae var.nicotianae）均具有強烈的拮抗作用，菌株YC0136對煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）也具有很強的拮抗能力。煙草黑脛病病原菌（Phytophthora nicotianae var.nicotianae）由山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院張廣民教授惠贈。其他供試菌株由本實驗室篩選保存。

1.1.5 培養(yǎng)基 拮抗菌活化采用LB培養(yǎng)基，拮抗菌搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基（黃豆芽 200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1000 mL），黑脛病病原菌活化采用燕麥培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 拮抗菌活化后在30 ℃、170 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 3 d，用無菌水稀釋成 1×108CFU/mL。黑脛病病原菌采用楊建卿（2001）的方法[11]，制備成濃度為104個/mL游動孢子懸液。

1.2.2 試驗設計 試驗在山東農(nóng)業(yè)大學日光溫室內(nèi)進行，設置4個處理，即A：接種生防菌YC0573；B：接種生防菌YC0136；C：施加甲霜靈錳鋅作為藥劑對照；D：發(fā)病對照。5次重復，每重復 3棵煙苗。

選擇長勢一致的5～6片真葉期的煙苗，移栽前將煙草幼苗在 1×108CFU/mL濃度的 YC0573或YC0136菌液中浸根30 min，然后將煙苗移栽至盆中，藥劑對照和發(fā)病對照采用培養(yǎng)基浸根。緩苗3 d后用移液槍頭將相應的菌懸液(1×108CFU/mL)灌入煙株根際，每株煙4 mL菌液，同時取1 mL菌液淋于莖基部，發(fā)病對照接入等量培養(yǎng)基，藥劑對照采用58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑500倍稀釋液澆灌處理，每盆150 mL。1 d后將配制好的黑脛病游動孢子菌懸液(104個/mL)灌接于各處理煙苗根部，接種量為5 mL/株。其余按照溫室常規(guī)管理，澆水保濕以利于發(fā)病。

1.2.3 防病及促生效果調(diào)查 接種病原菌7 d后，按照文獻[12]調(diào)查各處理煙株的發(fā)病情況和農(nóng)藝性狀，計算各處理煙株的病情指數(shù)、發(fā)病率和相對防效。煙草種植期結(jié)束后，取出煙株用清水洗凈，自然條件下風干后測量煙株鮮質(zhì)量，將煙株放置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測整株干質(zhì)量。

1.2.4 煙草葉片生理指標的測定 煙株移栽后30、60、90 d時，各處理取從上至下數(shù)第4片展開的葉片，剪碎混合均勻后測定以下指標，3次重復取平均值。

葉綠素含量、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照文獻[13]，多酚氧化酶（PPO）活性采用文獻[14]的方法，過氧化氫酶（CAT）采用過氧化氫分解量法測定[15]，電解質(zhì)相對滲透率用電導法測定[15]。

1.2.5 煙草根系發(fā)育情況測定 煙草生長期結(jié)束后，移出整個煙株，用清水洗凈風干后稱取煙株地下部分鮮質(zhì)量，計算煙株的根冠比。根系活力的測定采用TTC法[16]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 18.0軟件，Duncan新復極差法，在0.05水平上分析差異顯著性(p＜0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌對煙草病害的防治效果

由表1看出，接種拮抗菌可推遲煙草的發(fā)病時間，煙草病情指數(shù)明顯低于對照。接種 35 d后YC0573的相對防效可達到90.9%，YC0136的相對防效達到95.4%，兩株拮抗菌對黑脛病的防效均高于農(nóng)用藥劑甲霜靈錳鋅（86.4%）。

表1 拮抗菌對煙草黑脛病溫室防效Table 1 Effect of tobacco black shank in greenhouse

2.2 拮抗菌對煙株生長發(fā)育的影響

由圖1可以看出，YC0573、YC0136處理煙株的長勢要優(yōu)于甲霜靈錳鋅、發(fā)病 CK，其中株高和最大葉面積 2項指標最為明顯，表現(xiàn)在各時期YC0573、YC0136處理均與發(fā)病CK差異顯著。與甲霜靈錳鋅處理相比，除60 d株高外，差異也都達到顯著水平。各處理煙株在60 d時長勢差距較為明顯，YC0573處理株高、莖圍、葉數(shù)、最大葉面積分別比發(fā)病 CK提高 75.18%、17.73%、28.33%和70.92%，差異顯著，和甲霜靈錳鋅處理相比，莖圍、葉數(shù)、最大葉面積分別高出 10.51%、26.23%、65.75%，差異顯著；同時期YC0136處理株高、莖圍、葉數(shù)、最大葉面積分別比發(fā)病CK高出83.71%、24.73%、23.33%和 82.58%，差異顯著；與甲霜靈錳鋅處理相比莖圍、葉數(shù)、最大葉面積分別高出17.08%、21.31%、77.04%，差異達到顯著水平。煙草生長的后期，接種生防菌的煙株依然能夠表現(xiàn)出一定的生長優(yōu)勢。

由表2看出，用生防菌株處理的煙株干質(zhì)量與對照間的差異均達到顯著水平，YC0573、YC0136處理分別比發(fā)病CK高出53.38%和64.19%；與甲霜靈錳鋅處理相比高出44.25%和54.41%。煙株鮮質(zhì)量方面，YC0136處理和對照間的差異能夠達到顯著水平，比發(fā)病CK高出28.80%，比甲霜靈錳鋅處理高出22.45%。無論是鮮質(zhì)量還是干質(zhì)量，甲霜靈錳鋅、發(fā)病CK之間差異均不顯著。

2.3 煙草葉片系統(tǒng)抗性相關(guān)生理指標

圖1 不同生長期各處理煙株農(nóng)藝性狀Fig.1 Agronomic traits of tobacco in different growing phase

表2 各處理煙株生物量Table 2 Biomass of tobacco

表3 拮抗菌對煙草葉片部分生理指標的影響Table 3 Effect of antagonism bacterium on physiological index of tobacco leaves

從表3可以看出，4種處理的煙株葉片除電解質(zhì)相對滲透率外的各項指標均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，處理間差異主要體現(xiàn)在煙株移栽后30和60 d時，即團稞期和旺長期，90 d時差異不大。60 d時生防菌處理煙株與對照間差異最為明顯，7項指標的差異均可達到顯著水平，YC0573處理葉綠素含量、SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性分別比發(fā)病CK高出20.77%、15.42%、17.25%、24.53%、24.60%和 35.68%，電解質(zhì)相對滲透率低于發(fā)病CK 31.15%；YC0136處理葉綠素含量、SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性分別比發(fā)病CK高出14.97%、12.12%、19.00%、27.57%、29.90%和 47.13%，電解質(zhì)相對滲透率比發(fā)病CK低33.24%；甲霜靈錳鋅處理各項指標中僅有PPO和PAL活性兩項高于發(fā)病CK且差異顯著，分別高出7.96%和16.62%，POD活性反而低于發(fā)病CK。30 d時，YC0573、YC0136處理葉綠素含量、電解質(zhì)相對滲透率、PPO、PAL、CAT活性共5項指標與發(fā)病CK差異顯著，YC0136處理POD含量與發(fā)病CK的差異也達到顯著水平，而甲霜靈錳鋅處理僅有電解質(zhì)相對滲透率和 CAT活性兩項指標和發(fā)病 CK差異顯著。90 d時，YC0573、YC0136處理只有PPO活性與發(fā)病CK差異都能夠達到顯著水平，此外YC0573處理的電解質(zhì)相對滲透率也與發(fā)病CK差異顯著，而甲霜靈錳鋅處理各項指標與發(fā)病CK間均無顯著性差異。

整體上來看，兩株拮抗菌對煙株葉片生理指標的影響大致相同，YC0573對葉綠素含量、SOD活性的影響更大，而YC0136對其他5項指標的影響更為明顯。

2.4 煙草根系發(fā)育

表4顯示，生防菌能夠促進煙草根系的發(fā)育，提高煙草的根系活力，農(nóng)用藥劑對煙株的根系發(fā)育反而有一定的遏制。YC0573、YC0136處理地下部分鮮質(zhì)量大于甲霜靈錳鋅、發(fā)病CK，其中YC0136處理與發(fā)病CK差異顯著，增加43.56%；YC0573、YC0136處理的根冠比與甲霜靈錳鋅、發(fā)病CK相比有增大的趨勢，但是差異不顯著；YC0573、YC0136處理煙株根系活力分別比發(fā)病 CK高出13.13%和13.63%，差異顯著；而甲霜靈錳鋅處理煙株根系活力相比于發(fā)病CK有降低的趨勢，但差異不顯著。

表4 煙草根系發(fā)育情況Table 4 Root development of tobacco

3 討 論

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）作為生防細菌在國內(nèi)外均有報道，該菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對很多植物病原菌具有抑制作用，同時可以促進作物生長，誘導作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[17-18]。因其具有防病效果好、對人畜安全和無環(huán)境污染等優(yōu)點而受到重視，我國農(nóng)業(yè)部將其列為免做安全鑒定的一級菌種。本試驗結(jié)果表明，煙草根際接種多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573和YC0136顯著降低了黑脛病病情指數(shù)，接種35 d后溫室相對防效分別達到90.9%和95.4%，防治效果好于甲霜靈錳鋅，同時能夠促進煙草的生長發(fā)育。對煙草根系發(fā)育的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)兩株細菌都能夠不同程度的促進煙草的根部生長，根系活力高于對照，而施加甲霜靈錳鋅的煙株根系活力反而略低于發(fā)病對照，這可能是因為甲霜靈錳鋅抑制了土壤中某些對煙草根系發(fā)育起到重要作用的微生物所致。

研究表明，生物因子和非生物因子等多種誘導因子可誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[19-20]。各種誘導因子都可以誘導植物體內(nèi)SOD、POD、CAT、PAL、PPO等防御酶活性的升高以及葉綠素、電解質(zhì)相對滲透率等生理指標的改變。其中SOD、POD和CAT與植物體內(nèi)活性氧的清除密切相關(guān)[21]，PAL和 PPO與植物體內(nèi)酚類代謝和木質(zhì)素的形成有關(guān)，是與系統(tǒng)抗性密切相關(guān)的酶[22]，葉綠素含量是衡量植物光合作用能力的大小重要指標，植物受到逆境脅迫時葉綠素含量會有所下降，電解質(zhì)相對滲透率則反映了植物對病原菌抵抗力的強弱，細胞電解質(zhì)滲透率小則不易受到病原菌的侵害。Liang等[21]通過分根法在黃瓜根部分別接種生防菌 L8和猝倒病病原菌發(fā)現(xiàn)黃瓜根部和葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL活性均顯著升高，并且降低了黃瓜幼苗猝倒病的發(fā)病率；Vanitha等[23]研究發(fā)現(xiàn)番茄根際接種熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）增強了番茄對青枯病的抗性，PPO、PAL等防御酶活性顯著提升，并且通過RT-PCR手段發(fā)現(xiàn)有關(guān)酶合成基因的表達水平顯著升高；王芳等[24]從細菌B6中提取出一種活性蛋白，直接處理煙草葉片后提升了葉片PPO、POD、PAL的活性，增強了葉片對黃瓜花葉病毒的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)拮抗細菌YC0573和YC0136誘導系統(tǒng)抗性好于化學誘導因子（甲霜靈錳鋅），葉片中幾種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照，電解質(zhì)相對滲透率比對照有所降低，同時溫室試驗中發(fā)現(xiàn)接種生防菌的煙草花葉病發(fā)病率比對照有所降低，最高幅度可達33.33%，以上結(jié)果證明兩株生防細菌可誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強煙草對病害的抵抗力。煙草移栽60 d時，生防細菌誘導系統(tǒng)抗性作用最為顯著，此時也是煙草田間病害的高發(fā)期，誘導作用在煙草生長后期仍有一定體現(xiàn)。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，溫室條件下拮抗菌 YC0573和YC0136對煙草黑脛病具有良好的防治作用，同時證明了兩株菌均能夠誘導煙株系統(tǒng)抗性，具有很強的應用潛力。試驗中首先對煙株浸根處理，使生防菌在煙株根部和根際土壤中占據(jù)有利的生態(tài)位點，結(jié)果顯示此種處理方式生防菌的功效表現(xiàn)較好，這為生防菌在田間應用方式提供了有價值的參考，有關(guān)生防菌在煙草根部的定殖能力和田間應用效果還有待進一步的試驗證明。

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