MACC1基因?qū)θ诵〖?xì)胞肺癌細(xì)胞株SBC－5細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其中小細(xì)胞肺癌約占肺癌總發(fā)病率的25%，臨床以早期播散為主要特點，預(yù)后極差。MACC1基因是2009年才發(fā)現(xiàn)的與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)的新基因［1］。研究顯示，MACC1基因作為肝細(xì)胞生長因子HGF／MET信號通路的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，與結(jié)腸癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［2］。隨后多項研究證實在腎癌、胃癌、膀胱癌和肝癌等癌組織中發(fā)現(xiàn)了MACC1表達(dá)上調(diào)［3－5］。但是目前為止，MACC1表達(dá)水平與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。本研究通過siRNA干擾的方法探討MACC1基因?qū)θ诵〖?xì)胞肺癌細(xì)胞株SBC－5細(xì)胞的凋亡作用。

材料與方法

1 材 料 SBC－5細(xì)胞（人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株）由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中心實驗室提供；人siRNAMACC1及與基因組序列無同源的陰性對照siRNA－control購自美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑TransMessenger購自Qiagen公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Invitrogen公司；MACC1大鼠抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司；MTT試劑和Hoechst 33342染料購自碧云天公司；引物由上海英駿公司合成。

2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及siRNA轉(zhuǎn)染 SBC－5細(xì)胞用含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下，隔日換液、傳代。在轉(zhuǎn)染前1天，收獲處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×104個／孔接種6孔板，分為3組：空白對照組（A組）；siRNA－control組（B組）；siRNA－MACC1組（C組）。細(xì)胞生長至80%～90%融合。應(yīng)用TransMessenger進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按說明書操作，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行后續(xù)分析。

3 Western blot檢測 MACC1蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞中加入100μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上刮取細(xì)胞，裂解30min，4℃12000rpm 離心15min；BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，經(jīng)100℃ 煮沸5min變性后上樣，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳結(jié)束后，采用Bio－Rad半干轉(zhuǎn)膜儀，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜；轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入羊抗人MACC1抗體及內(nèi)參照β－actin單克隆抗體，4℃過夜；二抗室溫孵育2h。最后PVDF膜浸入等體積混合的ECL顯色劑A液和B液中約1min，經(jīng)Western blot成像系統(tǒng)獲取結(jié)果。比較 MACC1蛋白表達(dá)水平的變化。

4 MTT法檢測體外細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104／ml，按200μl／孔分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5個復(fù)孔每組，每塊96孔板均另設(shè)空白對照組（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），設(shè)置6個時間點（12、24、36、48、60和72h）后進(jìn)行 MTT 檢測。每孔加入 20μl MTT（5g／L），孵育4h后，棄上清，每孔加入二甲基亞砜150μl，振蕩10min，使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490nm波長處檢測各孔的OD值，試驗重復(fù)3次，最后繪制細(xì)胞增殖曲線。

5 細(xì)胞凋亡分析 各組細(xì)胞加入Hoechst 33342染色液（5μg／ml），CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)10min，棄去上清，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下激發(fā)波長346nm，發(fā)射波長460nm觀察和拍照。

6 統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA對SBC－5細(xì)胞MACC1蛋白的影響

收取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h的細(xì)胞，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示空白對照組、siRNA－control組和siRNAMACC1組MACC1蛋白的相對表達(dá)量分別為0．726±0．103、0．774±0．086和0．235±0．028。空白對照組和siRNA－control組相比，MACC1蛋白表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0．05），與空白對照組和siRNA－control組相比，siRNA－MACC1組 MACC1蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異具有顯著性（P＜0．05）

2 siRNA對SBC－5細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示：空白對照組、siRNA－control組和siRNAMACC1組OD值在72h時變化最為顯著，分別為1．446±0．011、1．397±0．073和0．484±0．084。空白對照組和siRNA－control組72h時的OD值無顯著性差異（P＞0．05），與空白對照組和siRNA－control組相比，siRNA－MACC1組72h時OD值明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）（見圖1）。

圖1 各組細(xì)胞增殖曲線

3 siRNA對SBC－5細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33342熒光染色結(jié)果顯示：空白對照組和siRNA－control組細(xì)胞無明顯凋亡，siRNA－MACC1組凋亡細(xì)胞明顯增加，其中呈致密的顆粒狀、塊狀濃染熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞（見圖2）。

圖2 各組細(xì)胞Hoechst33342染色結(jié)果（bar＝100μm）

討 論

研究表明，肝細(xì)胞生長因子HGF／MET信號通路在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)程中，尤其在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。HGF／MET信號通路參與細(xì)胞的許多生命活動，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和遷移［6］。新近發(fā)現(xiàn)的 MACC1基因已經(jīng)被證實是HGF／MET信號通路的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，可結(jié)合MET啟動子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、運動、轉(zhuǎn)移、侵襲及血管生長。有人研究了MACC1基因在結(jié)腸癌和胃癌中的作用，結(jié)果提示MACC1基因在結(jié)腸癌、胃癌上皮細(xì)胞表型的分化、腫瘤新生血管形成、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中起到重要作用，其表達(dá)水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［7］。

本研究將MACC1基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染SBC－5細(xì)胞，成功抑制了 MACC1mRNA和蛋白的表達(dá)；MTT實驗結(jié)果顯示siRNA－MACC1組細(xì)胞OD值明顯減少，提示其體外增殖受到明顯抑制；Hoechst 33342熒光染色結(jié)果顯示siRNA－MACC1組凋亡細(xì)胞明顯增加，提示低表達(dá)MACC1蛋白可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果表明，MACC1基因在小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，可以參與小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞凋亡和增殖等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，抑制該基因的表達(dá)，可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡和抑制其增殖。

綜上所述，MACC1基因在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，可能通過參與肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡，對小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展、早期轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)，具有成為小細(xì)胞肺癌新的治療靶點的可能。進(jìn)一步的研究將明確其在小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展生中的具體機制，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

［1］ Ulrike S，Wolfgang W，F(xiàn)ranziska A，et al．MACC1，a newly identied key regulator of HGF－MET signaling，predicts colon cancer metastasis［J］．Nat Med，2009，15（1）：59－67．

［2］ Arlta R，Stein U．Colon cancer metastasis：MACC1and Met as metastatic pacemakers［J］．Int J Biochem Cell Biol，2009，41（12）：2356－2359．

［3］ 吳 健，張 昶，朱亞寧．MACC1在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義［J］．江蘇醫(yī)藥，2011，37（11）：101－102．

［4］ 陳 忠，謝 峰，鐘豐云，等．胃癌組織中MACC1基因的表達(dá)及意義［J］．臨床檢驗雜志，2013，31（2）：102－114．

［5］ 劉清泉，劉青光，昝獻(xiàn)峰，等．MACC1基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：22－25．

［6］ Montesano R，Matsumoto K，Nakamura T，et al．Identification of a fibroblast derived epithelial morphogen as hepatocyte growth factor［J］．Cell，1991，67（2）：901－908．

［7］ Stein U，Smith J，Walther W，et al．MACC1controls Met：what a difference an Sp1site makes［J］．Cell Cycle，2009，8（15）：2467－2469．