FGFR2功能獲得性突變對長骨發育過程的影響

陳鵬，張波，張莉，張連陽

FGFR2功能獲得性突變對長骨發育過程的影響

陳鵬，張波，張莉，張連陽

目的對比觀察Fgfr2+/S252W突變型小鼠和同窩野生型小鼠長骨的生長發育情況，探討FGFR2功能持續增強對軟骨內成骨過程的影響。方法采用經基因敲入技術建立的模擬人Apert綜合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，經繁殖、鑒定后分為Fgfr2+/S252W功能獲得突變型和同窩野生型。于出生后7、10、14、28d分別處死突變型和野生型小鼠各3只，對長骨進行長度測量、X線檢查及M icro CT檢查，另取部分長骨標本進行HE染色和免疫組化染色觀察。結果Fgfr2+/S252W突變小鼠呈典型Apert綜合征圓顱和短顱畸形，體形發育緩慢，體長、四肢長度明顯小于同窩野生小鼠，且長骨發育障礙，第二骨化中心延遲出現，骨密度及骨小梁數量低于同窩野生型小鼠。組織學觀察可見突變小鼠脛骨近端生長板軟骨細胞增殖區和肥大區厚度縮短，細胞排列不及野生型整齊，肥大軟骨細胞體積小，免疫組化檢測顯示軟骨相關增殖、分化基因表達均減弱。結論FGFR2功能持續增強可導致小鼠長骨發育障礙。FGFR2可能具有調控成骨細胞系及軟骨細胞系發育的功能，在骨骼發育等方面發揮重要作用。

受體，成纖維細胞生長因子，2型；尖頭并指(趾)畸形；軟骨發生；骨生成

骨生成主要通過軟骨內成骨和膜內成骨兩種方式，其中長骨發育以軟骨內成骨為主。Apert綜合征是一種顱縫早閉疾病，由2型成纖維細胞生長因子受體(fibroblast grow th factor receptor 2，FGFR2)的功能增強型點突變引起，患者表現為冠狀縫早閉，四肢短小畸形和并指/趾[1-2]。既往研究顯示FGFR2主要調控骨發育的成骨過程[3-4]，而其對軟骨內成骨的影響研究甚少。有研究顯示，長骨骺端軟骨組織中存在FGFR2的表達，且FGFR2功能增強可導致顱底軟骨發育障礙[5]，結合Apert綜合征患者四肢發育畸形的表現，推測FGFR2可能在軟骨組織的生長發育過程中發揮一定的調控作用。本實驗采用經基因敲入(knock in)技術建立的模擬人Apert綜合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，對比觀察同窩野生型和FGFR2獲得性增強突變型小鼠的長骨發育情況，以探討FGFR2功能增強能否影響軟骨內成骨過程，從而影響整個長骨的發育。

1 材料與方法

1.1動物來源 將從美國NIH引進的雄性帶neo基因+突變FGFR2的基因工程小鼠[6]、雄性EII-Cre小鼠分別與雌性C57BL/6J小鼠(2～4月齡)交配，得到的F1代經鑒定帶neo基因+突變FGFR2的基因小鼠，將其與F1代EII-Cre小鼠再次交配，EII-Cre啟動子去掉FGFR2-neo-S252W的neo基因，在子代中獲得約1/4數量的Fgfr2+/S252W功能獲得性突變小鼠。對小鼠進行基因型鑒定，按照基因型分為野生型和突變型(Fgfr2+/S252W)兩組，每組中每個檢測時間點3只。EII-Cre、C57BL/6J小鼠由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。所有小鼠均為SPF級，在實驗過程中由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心飼養。

1.2主要儀器與試劑 臺式高速冷凍離心機(Sigm a，Germ any)，PCR儀(GeneAm p，Hong Kong)，電泳儀、凝膠成像系統(Bio-Rad，USA)，數字X線攝影機(LORAD，USA)，M icro CT(Scanco M ed ical，Sw itzer land)，組織切片機(Leica，Germany)，顯微鏡(O lympus，Japan)，Spot內置彩色數碼相機(Diagnostic Instruments，USA)。蛋白酶K(Roche，USA)，EDTA粉(上海生物工程有限公司)，膠原Ⅱ(Col Ⅱ)、膠原Ⅹ(Col Ⅹ)、抗體(Santa Cruz，USA)，即用型SABC免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3Fgfr2+/S252W小鼠基因型的鑒定[6]剪取小鼠尾巴，長約2mm，用含100mg/L蛋白酶K的組織裂解液56℃裂解12h，提取基因組DNA。用以下引物進行擴增：①帶neo基因+突變FGFR2小鼠。R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'；RINA：5'-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3'。②EII-Cre小鼠。C1：5'-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3'；C 2：5'-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3'。③Fgfr2+/S252W小鼠。R2I6F1：5'-TAGGTAGTCCA TAACTCGG-3'；R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATG TGGGGC-3'。PCR產物凝膠電泳后，根據條帶對小鼠進行區分(圖1)。

圖1 基因鑒定電泳圖Fig. 1 PCR electrophoresis image of gene identification

1.4標本取材 對同窩出生的小鼠根據鑒定結果分為野生組和突變組，兩組分別取7、10、14、28d齡小鼠(每組每時間點3只)，采用頸椎脫臼法處死，留取下肢作為標本進行實驗。

1.5小鼠骨骼X線檢測 采用美國LORAD公司的鉬靶X線機(型號Selenia)對同窩野生型和突變型小鼠進行X線攝像(參數為電壓32kV，曝光時間10ms)，初步觀察兩種基因型小鼠下肢骨形態及骨皮質密度、骨小梁情況等指標。

1.6小鼠股骨M icro CT掃描 采用瑞士Scanco Medical小動物M icro CT掃描儀對小鼠股骨進行掃描及三維重建。將股骨周圍軟組織清除干凈，70%乙醇固定過夜后，垂直于水平面放入樣品管中進行掃描。掃描參數為電壓70kV，電流113μA，中分辨率(20μm)。

1.7組織病理學觀察 脛骨取材后經4%多聚甲醛固定3d，10% EDTA脫鈣3周，常規石蠟包埋、切片(厚6μm)，HE染色，封固，光鏡下觀察長骨生長板軟骨組織的增殖、分化情況。

1.8免疫組織化學染色觀察 石蠟切片脫蠟、水化，3%H 2O2室溫孵育10m in，PBS漂洗后山羊血清封閉30m in，加入一抗(Col Ⅱ、Col Ⅹ)4℃過夜，PBS漂洗后加入適量二抗工作液(37℃、45m in)，再次PBS漂洗后加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(37℃、30m in)，PBS漂洗后，DAB顯色5m in，自來水沖洗，脫水，封固，光鏡下觀察。

1.9統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據結果以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組小鼠生長發育情況 肉眼觀察顯示，Fgfr2+/S252W小鼠從出生時整個體形即小于同窩野生型小鼠，且行動遲緩，反應遲鈍。出生后1周左右，Fgfr2+/S252W小鼠逐漸顯現出異常的頭顱形態，隨時間延長，頭顱的縱向短縮更加明顯，類似人類Apert綜合征顱骨表型，即圓顱和短顱畸形，中臉縱向發育不良，而橫徑增加，伴下切牙開始向前增長。Fgfr2+/S252W小鼠體形發育緩慢，體長、四肢長度明顯短于同窩野生小鼠，呈侏儒表型，但未發現并指/趾畸形[7](圖2)。2.2兩組小鼠長骨發育的X線表現 對同窩野生型和Fgfr2+/S252W突變小鼠進行下肢X線攝像檢查發現，突變小鼠各時間點的下肢骨長度明顯短于同窩野生型小鼠(表1)。由圖3可見，在發育過程中，Fgfr2+/S252W小鼠肢體長度短于野生型小鼠，且骨皮質光密度偏低，干骺端骨小梁稀疏；在干骺端軟骨骨化過程中，野生型小鼠10d左右出現第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠未出現第二骨化中心，提示其存在軟骨內成骨障礙。

圖2 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠生長發育情況Fig. 2 Body and skull development of Fgfr2+/S252W(MT) and w ild type (WT) m ice

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨長度比較(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨長度比較(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

(1)P＜0.001 compared with WT

Location 7d 10d 14d 28d WT MT WT MT WT MT WT MT Femur 4.70±0.13 3.88±0.16(1)6.52±0.15 5.40±0.17(1)8.59±0.18 7.16±0.17(1)11.19±0.17 9.46±0.17(1)Tibia 6.38±0.10 5.12±0.14(1)8.60±0.15 7.21±0.14(1)11.04±0.18 9.59±0.16(1)15.10±0.24 12.88±0.21(1)

圖3 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠長骨發育的X線結果比較Fig. 3 X-ray examination of long bone development in mutant type (MT) and wile type (WT) mice

2.3兩組小鼠長骨干骺端發育的M icro CT觀察 采用M icro CT對4周齡的小鼠干骺端骨小梁進行掃描發現，Fgfr2+/S252W小鼠骨組織含量明顯低于同窩野生型小鼠，且股骨干骺端骨小梁明顯減少、稀疏(圖4)。

2.4兩組小鼠長骨發育的組織學觀察 由圖5可見，HE染色顯示，發育至第7天，Fgfr2+/S252W小鼠長骨生長板軟骨細胞基本呈柱狀排列，但不及野生型排列整齊，且肥大軟骨細胞體積較小，軟骨細胞增殖區和肥大區縮短；發育至第10天，野生型小鼠脛骨出現第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠長骨第二骨化中心未出現；發育至第4周，Fgfr2+/S252W小鼠脛骨干骺端骨小梁稀疏，且骨小梁長度縮短，與X線、M icroCT檢查結果一致。

2.5兩組小鼠脛骨生長板Col Ⅱ、Col Ⅹ的表達免疫組化染色顯示，發育至第5天，Col Ⅱ主要在生長板增殖層軟骨表達，而Col Ⅹ在生長板肥大層軟骨表達。與野生型小鼠比較，Fgfr2+/S252W小鼠生長板軟骨Col Ⅱ、Col Ⅹ免疫組化染色顏色淡，增殖層、肥大層陽性細胞數量少(圖6)。

圖4 4周齡Fgfr2+/S252W和野生型小鼠干骺端M icro CT掃描結果Fig. 4 M icro CT image of femur metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice, 4 weeks after birth

圖5 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠脛骨干骺端組織形態比較(HE ×100)Fig. 5 Comparison of tibia metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice (HE ×100)

圖6 5日齡Fgfr2+/S252W和野生型小鼠脛骨近端生長板軟骨Col Ⅱ、Col Ⅹ的表達(免疫組化 ×100)Fig. 6 Col Ⅱ and Col Ⅹ expression in tibia grow th plate of mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice 5 days after birth (Immunohistochemistry ×100)

3 討 論

FGFR屬于受體酪氨酸蛋白激酶(recep to r tyrosine kinase，RTK)家族，包括FGFR1、2、3、4共4種受體，它們通過與FGF結合發揮生物學功能。近年來研究發現FGF信號與骨骼發育有密切關系[1,8]。

既往研究認為，在軟骨內成骨過程中發揮調控作用的FGFR主要是FGFR3，可在胚胎發育形成骨化中心前對增殖和前肥大軟骨細胞進行調控，對軟骨發育起到負性調節作用[9-11]，而FGFR2主要調節成骨細胞發育，可調控位于軟骨膜、骨膜和顱縫處的前骨生成細胞和骨生成細胞的增殖及分化[4]。雖然已有少數研究在軟骨細胞系(尤其是成熟的軟骨細胞中)檢測到FGFR2的表達[12-14]，并發現其在顱底軟骨發育中具有重要作用[5]，但迄今為止FGFR2在骨骼發育過程中對軟骨內成骨的調控作用研究甚少。

應用基因敲入技術建立的FGFR2功能獲得型基因突變小鼠，其FGFR2功能增強，表現出類似人Apert綜合征的骨骼表型。除了顱縫早閉、圓顱畸形外，還存在體形減小及四肢短縮畸形[6-7,15]，因長骨的生長是軟骨內成骨過程，而該模型小鼠表現為軟骨內成骨發育不良，故考慮FGFR2功能持續增強可能與軟骨內成骨發育障礙有關。

本研究發現Fgfr2+/S252W小鼠在出生后發育早期體格較野生型弱小，四肢短縮。出生10d左右，突變型小鼠長骨第二骨化中心未出現，且骨發育過程中骨密度、骨小梁厚度明顯低于同窩野生小鼠。組織學觀察顯示，Fgfr2+/S252W小鼠長骨生長板軟骨增殖區和成熟肥大區細胞排列并未出現類似FGFR3功能增強模型小鼠軟骨細胞雜亂無序的排列[16]，但其軟骨細胞體積縮小，增殖、肥大帶厚度縮短，提示FGFR2功能持續增強可能抑制軟骨細胞增殖、分化，導致長骨軟骨內骨化障礙，是突變小鼠長骨短小、體形減小的組織學基礎。

FGF信號可通過與細胞表面的FGFR2結合而對成骨細胞和軟骨細胞的發育進行調控。Col Ⅱ主要由增殖軟骨細胞表達，而Col Ⅹ主要由肥大軟骨細胞表達，可作為軟骨增殖、分化的標志基因。本研究結果顯示，在出生早期，Fgfr2+/S252W小鼠Col Ⅱ、Col Ⅹ蛋白表達水平均較野生型下降，說明FGFR2功能持續增強導致小鼠軟骨增殖、分化功能減弱，使長骨軟骨內骨化過程受到抑制，這與傳統研究認為FGF是一種促細胞分裂劑，與受體結合后可增加細胞的增殖能力[17-18]有所矛盾，需進一步論證。

綜上，本研究證實FGFR2功能持續增強導致小鼠長骨發育障礙，FGFR2可能不僅具有調控成骨細胞系發育的功能，還具有調控軟骨細胞系發育的作用，從而可能影響膜內成骨和軟骨內成骨這兩個過程，在骨骼發育等方面發揮重要作用。雖然本研究證實FGFR2信號在骨骼發育過程中對軟骨細胞增殖和分化具有負性調節作用，但由于FGFR2主要調控成骨細胞的發育，長骨的短縮除了軟骨細胞發育障礙的因素外，是否同時有成骨細胞發育異常的參與有待進一步研究，且在骨發育過程中與軟骨發育相關的FGFR1、FGFR3表達是否存在代償性的變化值得更進一步探討。

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Influence of gain-of-function mutation (Ser252Trp) in fibroblast growth factor receptor 2 gene on long bone development

CHEN Peng1,2, ZHANG Bo1, ZHANG Li1, ZHANG Lian-yang*
1Institute of Field Surgery, State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Daping Hospital, Third Military MedicalUniversity, Chongqing 400042, China
2Department of Genera Surgery, 324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China
*

, E-mail: hpzhangly@163.com
This work was supported by the National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (2011CB964701)

ObjectiveTo observe the early postnatal long bone development in Fgfr2+/S252Wmutant m ice and littermate wild-type (WT) mice, and explore the effect of continued function enhancement of fibroblast grow th factor receptor 2 (FGFR2) gene on endochondral ossification.MethodsA mouse model of Fgfr2+/S252Wsimulated human Apert syndrome was reproduced by knock-in technique, and then the gain-of-function mutation Fgfr2+/S252Wm ice and littermate WT m ice were obtained after breeding and identification. Three Fgfr2+/S252Wand same number of WT mice were sacrificed at 7, 10, 14 and 28 postnatal days respectively, and the morphology of long bone was examined with X-ray and Micro CT, the structure of bone and cartilage was observed by HE staining, and the expression of gene in grow th plate was observed by immunohistochem ical analysis.ResultsFgfr2+/S252Wmouse model exhibited typical craniosynostosis and brachycephalium of Apert syndrome, accompanied by short stature, grow th retardation of long bone, delayed appearance of secondary ossification center, decrease of bone density and trabecula number. HE staining showed noticeable shortened zones of proliferation and hypertrophic chondrocytes, irregularity of cell arrangement, and small hypertrophic chondrocytes in the grow th plates of the mutant m ice. Immunohistochem ical analysis revealed that the expression of genes related to chondrocytes proliferation and differentiation was decreased in mutant mice.ConclusionsGain-of-function mutation in FGFR2 may lead to abnormal development of long bone in m ice. FGFR2 may have the function of regulating the development both of osteoblast and chondrocyte lineages, and play an important role in the process of skeletal development.

receptor, fibroblast grow th factor, type 2; acrocephalosyndactylia; chondrogenesis; osteogenesis

R682.19

A

0577-7402(2013)07-0540-05

2012-12-22；

2013-05-20)

(責任編輯：胡全兵)

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2011CB964701)

陳鵬，碩士研究生。主要從事軟骨內成骨方面的研究

400042 重慶 第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所，創傷、燒傷及復合傷國家重點實驗室[陳鵬(現在解放軍324醫院普通外科)、張波、張莉、張連陽]

張連陽，E-mail：hpzhangly@163.com