響應面設計法優化川貝母莖和葉中總生物堿的提取工藝

張劍光，徐 彥，劉 圓，呂露陽，曾 銳，張志鋒*

(西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 610041)

川貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，其中包括川貝母(卷葉貝母)、暗紫貝母、甘肅貝母或梭砂貝母等[1-2]。川貝母是食療佳品，可單獨研粉服用或者與梨蒸服，有清熱潤肺、化痰止咳的功效，與冰糖同食，其化痰止咳、潤肺養陰的效果更加明顯[3]。川貝母中含有多種類型化學成分，包括多糖、生物堿、核苷等。現代研究認為，總生物堿是其主要有效成分[4-6]，其藥理活性廣泛，包括鎮咳、祛痰、平喘、抗菌、鎮靜、鎮痛、心血管活性等。近年來有關川貝母鱗莖中生物堿含量的研究已有較多報道[7-12]，有關地上部分的研究較少，吳啟秀等[13]對川貝母地下和地上部分的HPLC指紋圖譜進行了比較，發現其含有一些相似的化學成分，但未進行含量測定。由于川貝母的大多來自野生資源，需求逐漸加大，導致野生資源日趨匱乏，因而其地上部分的食療價值也逐漸受到關注。

鑒此，本實驗對川貝母的資源品種之一卷葉貝母的莖、葉中的總生物堿進行研究，運用響應面設計試驗優化其總生物堿的提取工藝，并定量比較了人工種植和野生卷葉貝母莖、葉中的總生物堿含量差異，以期為川貝母植物的綜合利用及擴大藥源方面的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生卷葉貝母的莖和葉采于四川省康定縣折多山(海拔3800m)；人工種植卷葉貝母莖和葉采于四川省康定縣新都橋(海拔3400m)。

貝母素乙對照品(批號：110751-200709) 中國食品藥品檢定研究院；溴麝香草酚藍 新中化學廠；鄰苯二甲酸氫鉀 成都化學試劑廠；濃氨水 成都化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Unicam UV-500紫外分光光度計 美國熱電公司；Mettler AE240電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；W201B恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；多功能粉碎機 廣州雷邁公司。

1.3 方法

1.3.1 川貝母莖葉中總生物堿的提取

取川貝母莖、葉粉末0.5g，精密稱定置于50mL圓底燒瓶中，加入適量濃氨試液浸泡一段時間，加入氯仿-甲醇混合溶劑，水浴加熱回流提取，按照單因素考察、響應面設計表設定的條件進行提取，放冷過濾，揮干溶劑，用甲醇定容至25mL，靜置。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取干燥至質量恒定的貝母素乙對照品0.0125g，用甲醇溶解定容于25mL的容量瓶中，然后再精密吸取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5mL分別定容于10mL容量瓶中。分別吸取1mL標準品，置分液漏斗中，加氯仿14mL，鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液緩沖液(pH5.0)5mL，溴麝香草酚藍溶液2mL，充分振搖，靜置30min使充分分層，取下層氯仿液，用干燥濾紙濾過，取續濾液，在415nm處測定其吸光度[8]。以貝母素乙標準溶液質量濃度做橫坐標、吸光度做縱坐標，其回歸方程為Y＝4.799X－0.1353，R2＝0.9993，表明貝母素乙標準品質量濃度在0.050～0.25mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.3.3 貝母總生物堿的含量計算

精密吸取樣品溶液1mL，按1.3.2節中的測定方法測定其吸光度，重復3次，取其平均值為最終吸光度，再依據線性方程計算1mL樣品溶液中所含貝母總生物堿的量(mg)，即樣品溶液貝母總生物堿的質量濃度(mg/mL)，根據以下公式計算貝母總生物堿的含量。

式中：C為貝母總生物堿的質量濃度/(mg/mL)；V為提取液定容體積/mL；m為貝母粉末質量/g。

1.3.4 單因素試驗

稱取0.5g川貝母莖粉末分別加入4倍體積的氨水浸泡4h后，加入20倍體積混合溶劑(氯仿：甲醇＝4：1)，70℃水浴回流4h，以吸光度為指標評價提取效果，固定其他條件，分別考察氨水浸泡時間(1～8h)、液料比(10：1：1～50：1)、提取溫度(30～90℃)、提取時間(2～10h)對吸光度的影響。

1.3.5 響應面設計試驗

根據單因素的試驗結果和Box-Behnken試驗設計原理[14]，選取影響貝母莖總生物堿提取效果的主要因素氨水浸泡時間、提取時間、液料比、提取溫度，對這4個因素均設定3水平進行響應面設計試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 氨水浸泡時間

圖 1 氨水浸泡時間對總生物堿提取的影響Fig.1 Effect of ammonia soaking time on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖1可以看出，氨水浸泡時間對總生物堿的提取效果影響很大，提取效果隨氨浸泡時間的延長先增大后減小，浸泡時間為4h時達到最佳，隨后隨時間的延長而迅速減小。

2.1.2 液料比

圖 2 液料比對總生物堿提取效果的影響Fig.2 Effect of ratio of liquid to solid material on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖2 可以看出，開始時貝母總生物堿的提取效果隨液料比的增加而增大，增幅較明顯，說明此因素對提取效果的影響較大。當液料比達到3 0：1時，貝母總生物堿提取效果最好，繼續增大液料比時，總生物堿的溶出不再增加，故選擇30：1為最宜液料比。

2.1.3 提取溫度

圖 3 提取溫度對總生物堿提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖3可以看出，提取溫度對莖的總生物堿提取效果影響較大，提取效果隨溫度呈先上升后下降的趨勢，70℃時提取效果最好。這是因為溫度的升高，液體黏度下降，分子運動加快，加快溶質的擴散和溶劑的滲透，有利于生物堿的溶出，但隨著溫度的升高，部分熱穩定性小的生物堿也會隨之分解而影響貝母總生物堿的提取率。

2.1.4 提取時間

圖 4 提取時間對總生物堿提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖4可以看出，提取時間對總生物堿提取效果的影響也很大，提取效果隨提取時間的延長而先增大后減小，這可能是因為延長提取時間有利于藥材粉末和提取溶劑的充分接觸，利于貝母堿的溶出。但隨時間的延長也有可能會導致部分生物堿的分解而使提取效果下降。故莖的最宜提取時間為6h。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 模型的建立及顯著性試驗

表1 莖響應面分析方案及試驗結果Table 1 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of F. cirrhosa D. Don leaves

表2 回歸統計分析表Table 2 ANOVA for the response surface regression model

根據表1的結果，運用Design-Exper 7.0軟件對表2中的試驗數據進行多元擬合回歸，得回歸方程：Y＝1.54＋0.29A－1.54B＋0.45C＋0.013D＋0.045AB＋0.11AC－0.12AD＋0.19BC－0.20BD－0.090CD－0.41A2－0.48B2－0.43C2－0.39D2。模型系數顯著性結果和方差分析結果見表2。

表2的數據可知，該模型極顯著(P＜0.0001)，模型的R2＝0.9799，調整復相關系數R2Adj＝0.9188，模型失擬項P＝0.0747＞0.05，不顯著，說明該模型顯著，本試驗所得的二次回歸方程能很好地對響應值進行預測，擬合度好。

從表2可看出，一次項B，交互項BC、BD，二次項A2、B2、C2、D2表現為極顯著；一次項A、C，交互項AD表現為顯著；一次項D、交互項AB、AC、CD表現為不顯著。比較各因素的F值，可得出各因素多實驗結果的影響的大小順序B＞C＞A＞D，即提取時間＞液料比＞浸泡時間＞提取溫度。

2.2.2 響應面圖分析

利用Design-Exper 7.0軟件對表2數據進行二次回歸多元擬合，所得到的二次回歸方程的響應面圖見圖5。

圖 5 兩因素交互作用對貝母莖總生物堿得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of process parameters on the extraction effi ciency of total alkaloids from F. cirrhosa D. Don stems

該圖形直觀地給出了各因素交互作用響應面的3D圖，從響應面的最高點可以看出，在所選范圍內存在極值。從響應面曲面坡度的陡峭程度和等高線圖可以看出因素間交互作用的強弱和因素對響應值的影響程度。圖5表明提取時間和液料比的交互作用、提取時間和提取溫度的交互作用、氨水浸泡時間和提取溫度的交互作用較顯著。以圖5Ⅰ為例說明，在液料比30：1、提取溫度70℃的條件下，總生物堿含量隨提取時間的延長先增加后減小，亦隨氨水浸泡時間的延長先增加后減小。其他各圖依此分析，其分析結果與單因素試驗結果基本一致。

2.2.3 最佳提取工藝的優化

由Design-Exper 7.0軟件分析得到川貝母莖中總生物堿最佳提取工藝條件。莖的最佳工藝條件為氨水浸泡時間4.12h、提取時間6.37h、液料比30.74：1、提取溫度73.69℃，在此條件下提取總生物堿，含量可達2.8577mg/g。進行驗證實驗，將莖的最佳提取條件修正為氨水浸泡時間4h、提取時間6.5h、液料比31：1、提取溫度74℃，此條件下，人工種植川貝母莖中總堿的含量為2.7851mg/g，與理論預測值非常接近，因此，該方程能較真實地反映各因素對總堿提取效果的影響情況。

2.3 人工種植和野生川貝母莖、葉中總堿的含量比較

依據優化后的總生物堿提取工藝條件，對人工種植和野生川貝母的莖、葉進行總生物堿的提取，測定其含量，其結果見圖6。

圖 6 川貝母莖和葉中總堿含量結果Fig.6 Total alkaloid content of stems and leaves of wild and cultivated F. cirrhosa

3 結 論

綜合單因素和響應面設計試驗的結果，得出川貝母莖中總生物堿的最佳提取工藝為藥材粉碎粒度60目、4倍體積氨水浸泡、氨水浸泡時間4h、混合溶劑氯仿-甲醇(1：1)、液料比31：1、提取時間6.5h、水浴溫度74℃，此條件下，提取人工種植和野生川貝母莖、葉的總生物堿，得人工種植川貝母莖總生物堿含量為2.785mg/g，葉為3.708mg/g。野生莖總生物堿含量為3.235mg/g，葉為4.998mg/g。結果表明莖的總生物堿含量低于葉中的，同時人工種植的也低于野生的。

川貝母傳統的用藥部位是地下鱗莖，但川貝母莖、葉中含有較高的生物堿類成分，具體的成分還有待進一步的研究分析。本研究前期已經對地下鱗莖中總生物堿的最佳工藝進行了研究，表明地上部分總生物堿的含量高于地下部分，因此，川貝母的地上部分是否也可以作為食療佳品使用，其功能特點值得進一步的研究。

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