葡萄籽粗多糖的超聲波提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

王 強，趙 欣

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，食品安全與營養(yǎng)研究所，重慶 400067)

葡萄，葡萄科(Cucurbitaceae)，葡萄屬(Cucurbita)，是僅次于柑橘之后的世界第二大水果，含有多酚、礦物質(zhì)、維生素等生物活性成分[1-2]，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源。國內(nèi)外研究表明[3-5]，葡萄提取物對預(yù)防心血管疾病和抑制腫瘤生長等具有顯著的療效，葡萄提取物備受人們重視。現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)的研究表明葡萄中的活性多糖具有抑菌和抗氧化等功能，多糖研究已成為當(dāng)前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究與開發(fā)的熱點[6-8]。

據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計2004年全球葡萄總產(chǎn)量約6500萬t，其中約71%用來釀酒，產(chǎn)生的副產(chǎn)物皮渣等占到總加工量的20%[9-10]。在我國80%的葡萄用于釀酒，釀酒產(chǎn)生約25%(m/m)的皮渣，其中20%～26%是葡萄籽，因此，利用釀酒皮渣可以增加商品附加值[11-12]。但目前食品行業(yè)對葡萄籽資源的利用十分有限，若將這些廢棄的葡萄籽作為生產(chǎn)粗多糖的原料，可以提高原料利用率，同時產(chǎn)生大量的優(yōu)質(zhì)活性多糖。本實驗運用響應(yīng)曲面法進行超聲波提取葡萄籽粗多糖的最佳工藝研究，分析各因素對提取效果的影響，并對最終粗多糖的化學(xué)組成、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性等進行評價，對于葡萄籽粗多糖的科學(xué)研究、引導(dǎo)葡萄籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展、指導(dǎo)消費及宣傳具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma-Aldrich公司；Dextrans系列標(biāo)樣(T-10、T-40、T-70、T-500)、Sephadex-G150 瑞典Pharmacia公司；VC 成都科龍化工試劑廠；雙蒸水、所用溶液均自行配制；MD44-14型號透析袋 美國Union Carbide公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；超聲波 寧波新芝生物科技有限責(zé)任公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；凝膠色譜柱(1.6cm×100cm)、恒流泵、自動部分收集器 上海華美化學(xué)儀器廠；冷凍離心機 美國貝克曼公司；LSC真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計 上海菁海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取葡萄籽粗多糖

1.2.1.1 原料預(yù)處理

原料清洗、去除雜質(zhì)；將葡萄籽干燥置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(65℃)干燥至水分含量8%(烘箱法測定)；粉碎機粉碎，過60目篩。用95%的乙醇40℃熱處理2次，每次1h，以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質(zhì)的干擾，同時滅酶活以防止在超聲波提取過程中粗多糖的降解。抽濾、干燥，即得到預(yù)處理葡萄籽粉原料。

1.2.1.2 超聲波輔助提取葡萄籽粗多糖

預(yù)處理后的葡萄籽粉于設(shè)定條件(蒸餾水與葡萄籽液料比：10：1～50：1(mL/g，下同)；超聲功率：70～110W；溫度：30～70℃；超聲時間：10～50min)熱水提取2次，離心(3000r/min，10min)后合并上清液，95%乙醇、100%乙醇和丙酮分別處理，4℃放置24h后離心(3000r/min，10min)，溶解，Sevag方法脫蛋白[13]，透析(采用透析袋透析)后真空冷凍干燥，即得葡萄籽粗多糖(GSCPs)；GSCPs得率按式(1)計算。

1.2.2 單因素和響應(yīng)面試驗設(shè)計

單因素固定條件為：液料比20：1、超聲功率80W、超聲溫度40℃、超聲時間25min。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時間為自變量，GSCPs得率為響應(yīng)值(Y)，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，進行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。通過Design-Expert 7.1.6軟件(STAT-EASE Inc., Minneapolis，USA)對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，實驗結(jié)果通過多元回歸分析方法來擬合多元二次方程。

1.2.3 GSCPs組成分析

以葡萄糖為標(biāo)樣，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，具體參考方法見文獻[14]；蛋白質(zhì)含量測定參考AOCS Ba 4a-38方法[15]，灰分含量測定參考AOAC 942.05方法[16]；采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計測定GSCPs的相對黏度，GSCPs溶液質(zhì)量濃度為10mg/mL(25℃)[17]。

1.2.4 GSCPs分子質(zhì)量分析

采用凝膠過濾色譜法測定GSCPs分子質(zhì)量。分別將已知分子質(zhì)量(MW)的DextranT-10、DextranT-40、DextranT-70、DextranT-500(相對分子質(zhì)量分別為1萬、4萬、7萬、50萬)溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為2mg/mL。上Sephadex G-150凝膠柱(1.6cm×100cm)，以純水洗脫，上樣量1mL，流速24mL/h，自動部分收集儀收集洗出液，用苯酚-硫酸法于490nm波長處檢測葡聚糖，根據(jù)洗脫體積求得相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。以相同的條件將樣品上柱，根據(jù)洗脫體積，求得分子質(zhì)量[18]。

1.2.5 GSCPs清除DPPH自由基的測定

參照文獻方法Liu等[19]進行，將DPPH溶液1mL(10–4mol/L，95%乙醇)與不同質(zhì)量濃度(0～0.80mg/mL)的樣品和對照品(VC)溶液3mL混勻后于波長517nm處測定吸光度Ai，同時，將DPPH溶液1mL與樣品空白3mL混勻后測定吸光度Ac，將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液3mL與95%乙醇1mL混勻后測定吸光度Aj，按式(2)計算DPPH自由基清除率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 提取參數(shù)對GSCPs提取效果的影響

液料比是影響粗多糖提取效果的一個重要因素，根據(jù)傳質(zhì)速率理論，主要表現(xiàn)在影響固相體和液相體之間的濃度差。

圖 1 液料比(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)對GSCPs提取效果的影響Fig.1 Effect of water/raw material ratio (A), ultrasonic power (B), ultrasonic temperatures (C) and ultrasonic times (D) on yield of GSCPs

由圖1A可知，隨著液體比例的增加，GSCPs得率逐漸從0.94%增加到1.82%，當(dāng)液料比超過40：1時，GSCPs得率增大不顯著。由圖1B可知，隨著超聲功率的增大，GSCPs得率先增大后降低，當(dāng)超聲功率為100W時GSCPs得率達到最大值1.91%，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時，GSCPs得率降低，其可能原因是在較高的功率條件下，粗多糖發(fā)生降解。由圖1C可知，在超聲溫度30～40℃范圍，GSCPs得率增加不顯著，之后隨著超聲溫度增加，GSCPs得率呈逐漸增大的趨勢。但當(dāng)超聲溫度超過60℃時，GSCPs得率增加不顯著。超聲時間對GSCPs得率的影響與超聲溫度較為相似，如圖1D所示。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取粗多糖比傳統(tǒng)水提的效果更好。一方面，原因可能是超聲波輔助處理提高了粗多糖提取的效率；另一方面，超聲波輔助處理破壞了原料細胞壁組織，促使水溶性多糖與纖維素、蛋白質(zhì)等的連接健斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄远嗵牵铀倭硕嗵堑娜艹鯷20-21]。故本研究把液料比35：1～45：1、超聲功率95～105W、超聲溫度55～65℃、超聲時間35～45min作為響應(yīng)面試驗的考察范圍。

2.2 響應(yīng)面提取葡萄籽粗多糖工藝的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗

利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken試驗設(shè)計，以A料液比、B超聲功率、C超聲溫度、D超聲時間作四因素三水平試驗設(shè)計，可獲得GSCPs得率(Y)的試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。對表1中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，可建立如下二次回歸方程：

Y=2.22＋0.072A＋0.097B－0.15C－0.025D－0.067AB＋0.077AC－0.17AD－0.13BC－0.075BD＋0.050CD－0.18A2－0.10B2－0.18C2－0.13D2

表1 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology

表2 粗多糖得率回歸方程方差分析表Table 2 Analysis of variance of regression equations

對二次回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表2。Y的A、B、C、AC、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)出了顯著水平，二次回歸方程整體模型極顯著，并且失擬項不顯著，該回歸模型與實測值能較好地擬合。進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，模型Y的決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2Adj分別為95.00%和90.00%，均不小于90%，說明模型相關(guān)度很好，P＜0.0001，回歸模型極顯著。模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率[19]，表2中，失擬項P＞0.05，不顯著，因此證明該模型可以充分地解釋響應(yīng)中的變異，模型擬合度良好。

2.2.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化參數(shù)的優(yōu)化與驗證

為了考察交互項對GSCPs得率的影響，在其他因素條件固定為0水平時，考察交互項對GSCPs得率的影響，對模型進行降維分析。經(jīng)Design-Expert 7.1.6軟件分析，所得的響應(yīng)面圖見圖2。

Design-Expert軟件分析結(jié)果表明，回歸模型存在穩(wěn)定點編碼值(0.146, 1.000,－0.837,－0.661)，穩(wěn)定點的特征值表明穩(wěn)定點為最大值點，即液料比41：1、超聲功率105W、超聲溫度56℃、超聲時間37min時，GSCPs得率達到最大值(2.37%)。用此最優(yōu)提取條件進行驗證，得到GSCPs得率為(2.41±0.11)%，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化GSCPs提取工藝是可行的。

圖 2 粗多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the effects water/raw material ratio (A), ultrasonic power (B), ultrasonic temperatures (C) and ultrasonic times (D) on the yield of crude polysaccharides

2.3 GSCPs化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性

圖 3 超聲波輔助提取葡萄籽粗多糖的相對分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular size distribution of GSCPs

測定GSCPs的理化組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSCPs總糖含量為(73.25±3.79)%，其中含有(3.86±0.17)%蛋白質(zhì)和(2.60±0.14)%灰分，GSCPs黏度為(1.51±0.11)Pa·s。

采用凝膠過濾色譜法測定GSCPs分子質(zhì)量，如圖3所示。超聲波輔助提取GSCPs凝膠柱洗脫曲線主要有4個洗脫峰，且相對分子質(zhì)量分布范圍很寬，分別為13.59×104、4.55×104、1.68×104和1.02×104。

2.4 GSCPs清除DPPH自由基活性

自由基是新陳代謝的副產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡失調(diào)的情況下，過多的自由基和活性氧的產(chǎn)生、反應(yīng)會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及有機體的衰老。因此，探討粗多糖新資源對自由基的清除作用具有重要意義。DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517nm波長附近有強吸收(呈深紫色)。而當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH的孤對電子被配對，其517nm波長吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性。由圖4可知，GSCPs清除DPPH自由基的能力與VC較為接近，揭示了GSCPs具有較高的抗氧化活性。

圖 4 超聲波輔助提取GSCPs清除DPPH自由基能力Fig.4 DPPH free radical scavenging activity of GSCPs

據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道[3,6,22]，葡萄提取物的生物活性涉及抗氧化、抑菌、預(yù)防心血管疾病及抑制腫瘤生長等方面。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，GSCPs具有較高的清除DPPH自由基的能力。基于此，與其他合成抗氧化劑相比，GSCPs具有較高的清除自由基能力，可用于開發(fā)研制抗衰老的保健食品和輔助藥物。

3 結(jié) 論

葡萄籽是生產(chǎn)葡萄制品時的副產(chǎn)物，葡萄籽含有大量的膳食纖維和粗多糖等活性成分，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源。為提高葡萄籽粗多糖的提取率，本實驗通過超聲波輔助提取技術(shù)優(yōu)化了GSCPs提取工藝參數(shù)，測定了其理化組成、分子質(zhì)量分布和抗氧化活性。結(jié)果表明，最佳提取GSCPs工藝參數(shù)為蒸餾水與葡萄籽液料比41：1、超聲功率105W、超聲溫度56℃、超聲時間37min，在此條件下GSCPs得率為2.37%。此外，GSCPs分子質(zhì)量分布較廣，清除DPPH自由基實驗揭示了GSCPs具有較高的抗氧化能力。

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