超高效液相色譜法測定葡萄汁中單咖啡酰酒石酸的含量

龐海霞，馬鵬程，馬 麗，張旺喜,*

(1.湖北工業大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430068；2.中國地質大學材料與化學學院，湖北 武漢 430074；3.上海標檢產品檢測有限公司，上海 200131)

葡萄屬葡萄科，為落葉藤本植物，果實藥食兼用。近幾年，通過眾多學者的研究證實了葡萄具有抗毒殺菌、抗氧化減緩衰老、防癌抗癌、抗貧血、降低胃酸利膽、抗動脈粥樣硬化、補益和興奮大腦神經、利尿消腫等功效[1-4]。葡萄多酚是從葡萄中提取的天然植物多酚類活性物質，是葡萄中存在的所有酚類物質的總稱。按照其酚羥基數目、位置以及結合方式的不同，可分為黃酮類多酚和非黃酮類多酚，前者包括花青素(anthocyanins)、兒茶素(catechins)和黃酮醇(flavonols)等，而后者主要包括羥基苯甲酸(hydroxybenzoic acids)、羥基酸(hydroxycinnamic acids，HCAs)和芪類化合物(stilbenes)等[5]。它們主要分布在葉片和果皮中，果肉中的含量較少，而果汁中除了花色素外幾乎不含有其他的黃酮類，主要為一些非黃酮類型的酚酸類物質[6-7]。分析檢測酚酸類化合物的文獻報道較多，主要采用液相色譜的方法，大多采用較長的梯度洗脫方式分離盡可能多的化合物，并進行組分結構的確認。如Shui Guanghou等[8]建立了在90min內分析果汁中10種有機酸及21種酚酸類化合物的方法，但并沒有包含單咖啡酰酒石酸，Isabella等[9]采用60min的梯度分析鑒定了葡萄中15種酚酸類化合物，Sergio等[10]在86min內分析鑒定了葡萄酒中48種酚酸類化合物，William等[11]使用60min的梯度形式測定了市售果汁及飲料中13中酚酸類化合物。

葡萄中含量較高的HCAs主要有單咖啡酰酒石酸，單香豆酰酒石酸酯，單阿魏酰酒石酸酯和芥子酸等，其中單咖啡酰酒石酸是HCAs中主要的一種酚酸類物質，由一分子咖啡酸和一分子酒石酸酯化形成，占HCAs總量的80%～90%[12]。單咖啡酰酒石酸主要存在于葡萄果肉中，在葡萄生長和成熟過程中轉移至果汁中，因此葡萄果汁中含量較高，測定其含量對研究葡萄汁及其飲料的營養價值非常重要。國內還未見單咖啡酰酒石酸含量檢測的報道，本實驗建立測定葡萄汁飲料中單咖啡酰酒石酸含量的超高效液相色譜法，該法分析時間短，分離效果好，準確度和精確度好，不僅可用于葡萄汁飲料的分析，還可以測定葡萄其他產品如新鮮葡萄汁，葡萄酒及葡萄干等產品中單咖啡酰酒石酸的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄汁飲料樣品 市售。

單咖啡酰酒石酸對照品、甲酸(色譜純) 美國Sigma公司；乙腈(色譜純) 美國Merck公司；水為Mill-pore自制的超純水。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜系統(PDA光電二極管陣列檢測器、Masslynx軟件) 美國Waters公司；AG285型電子天平 瑞士Mettler-toledo公司；超純水儀 美國Milli-pore公司；5810R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆州市超聲儀器有限公司；水相針式過濾器及50mL聚丙烯離心管 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm× 150mm，1.8μm)；流動相A為含0.1%(V/V)甲酸的水，流動相B為含0.1%(V/V)甲酸的乙腈；梯度洗脫程序：0～3min：5% B；3～15min：5～20% B；15～16min：20～98% B；16～20min：98～98% B；20～21min：98～5% B；21～23min：5～5% B；流速0.3mL/min；檢測波長325nm；柱溫35℃；進樣量2μL。

1.3.2 對照品標準溶液的制備

精確稱取單咖啡酰酒石酸對照品約5mg，加水約5mL，配成質量濃度為1.00mg/mL的母液。取適量上述母液，加水稀釋，配制質量濃度為0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00μg/mL的對照品標準工作溶液。

1.3.3 對照品質量控制溶液的制備

取1.3.2節配制的單咖啡酰酒石酸對照品母液，加水稀釋，配制質量濃度為2.00、10.00、20.00μg/mL的對照品質量控制溶液。

1.3.4 供試品溶液的制備

取適量葡萄汁飲料樣品于50mL聚丙烯離心管中，在4000r/min離心10min，上清液用0.45μm水相針式過濾器過濾，取1mL濾液供液相色譜分析。

1.3.5 樣品的測定

將上述制備的對照品標準溶液，對照品質量控制溶液及供試品溶液按照1.3.1節的色譜條件進行分析，外標法定量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

在1.3.1節的色譜條件下，采用PDA光電二極管陣列檢測器，在200～400nm進行紫外吸收波長掃描，結果如圖1所示。單咖啡酰酒石酸在328nm有最大吸收，實驗中采用325nm為其檢測波長。在超高效液相色譜系統中使用1.8μm顆粒填料的色譜柱，系統壓力比常規液相色譜要大。實驗比較采用甲醇和乙腈作為有機溶劑流動相，用甲醇做流動相時，系統壓力明顯增大，同時在相同梯度條件下單咖啡酰酒石酸的保留時間增加，因此實驗中采用乙腈作為流動相。為了減小系統壓力，設定色譜柱溫度為35℃。單咖啡酰酒石酸為酸性物質，在流動相中添加甲酸作為調節劑，得到較好的色譜保留及色譜峰型。葡萄汁飲料樣品組成成分復雜，采用較長的色譜柱有利于提高色譜分辨率及與干擾組分的分離。實驗中采用150mm長的色譜柱及較緩的梯度洗脫方式，單咖啡酰酒石酸與其他組分得到了較好的分離，在選定的色譜條件下無其他組分干擾，測的單咖啡酰酒石酸含量較為準確。

圖 1 葡萄汁飲料中單咖啡酰酒石酸(A)和對照品(B)在200～400nm的紫外吸收譜圖Fig.1 UV spectra of cafteric acid standard and grape juice drink sample

2.2 線性關系的考察

對1.3.2節制備的對照品標準工作溶液，按照1.3.1節的色譜條件分析3個批次。以單咖啡酰酒石酸質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。單咖啡酰酒石酸在0.50～50.00μg/mL范圍內呈良好的線性關系，3批的R2均大于0.9999。

表1 線性關系Table 1 Linear relationship

2.3 準確度和精密度的考察

對1.3.3節制備的對照品質量控制溶液，按照1.3.1節的色譜條件進行分析，各添加量分3批重復測定3次，結果見表2。批內及批間準確度分別用測定的平均值與理論添加值相比，用百分數表示，結果為批內準確度在97.1%～106.0%之間，批間準確度在100.4%～102.2%之間。批內及批間精密度分別用批內及批間測定的相對標準偏差表示，結果為批內精密度在0.2%～3.5%之間，批間精確度在1.9%～4.1%之間。

表2 準確度和精確度Table 2 Accuracy and precision of the developed method

2.4 穩定性的考察

對1.3.3節制備的對照品質量控制溶液，分別于室溫下放置0、24h后按照1.3.1節的色譜條件進行分析，各添加量重復測定3次，取其平均值與理論值相比，測得室溫放置24h后樣品的準確性在97.1%～100.7%之間，表明對照品溶液室溫放置24h是穩定的。

2.5 重復性的考察

對1.3.3節制備的質量濃度為0.50μg/mL的對照品標準工作溶液樣品，按照1.3.1節的色譜條件進行分析，重復測定6次，RSD為2.5%，表明測定方法具有良好的重復性。

2.6 基質加標回收率的考察

取1.3.2節配制的單咖啡酰酒石酸對照品母液，加水稀釋，配制質量濃度為100.00μg/mL的工作溶液，取適量按照添加量2.00、10.00、20.00μg/mL添加于葡萄汁樣品，并按照1.3.4節處理樣品，再按照1.3.1節的色譜條件進行分析，葡萄汁基質樣品及添加單咖啡酰酒石酸各添加量的葡萄汁樣品重復測定3次，結果見表3，基質加標回收率在101.8%～109.0%之間。

表3 基質加標回收率實驗Table 3 Recovery of cafteric acid spiked matrix

2.7 樣品測定

圖 2 單咖啡酰酒石酸對照品及葡萄汁飲料樣品的液相色譜譜圖Fig.2 Chromatograms of cafteric acid standard and grape juice drink sample

取1.3.4節處理的市售葡萄汁飲料樣品，按照1.3.1節的色譜條件進行分析。液相色譜譜圖如圖2所示，圖中同時給出了單咖啡酰酒石酸對照品溶液的譜圖。單咖啡酰酒石酸的保留時間為7.45min，從圖2可以看出，葡萄汁飲料樣品成分非常復雜，但是在保留時間為7.45min處沒有其他干擾峰，因此初步認定該峰為單咖啡酰酒石酸。為了進一步確認，采用PDA紫外檢測器在200～400nm波長范圍內進行掃描，提取該峰的紫外吸收光譜圖，并與單咖啡酰酒石酸對照品的紫外吸收光譜圖進行比較，如圖1所示，兩者的紫外吸收譜圖一致，進一步證實葡萄汁飲料樣品中保留時間為7.45min的色譜峰為單咖啡酰酒石酸。

實驗測定市售葡萄汁飲料樣品中單咖啡酰酒石酸的含量見表4。可見不同品牌的葡萄汁飲料樣品，其單咖啡酰酒石酸含量各不相同，差異比較大。對葡萄種類相同的飲料，果汁含量越高，單咖啡酰酒石酸含量也越高。另外，對表4測定的樣品結果初步分析可以看出，單咖啡酰酒石酸含量與葡萄的品種有關，如品牌2#紅葡萄飲料比品牌3#紫玉葡萄及品牌4#水晶葡萄飲料的含量高，相比而言，品牌4#水晶葡萄飲料及未知葡萄種類的品牌6#中單咖啡酰酒石酸的含量非常低，均低于最低定量限0.50μg/mL。因為某些品牌的葡萄汁飲料沒有標示葡萄的種類，因此不能根據葡萄的品種進一步比較，如品牌5#雖然標簽標示100%果汁，但單咖啡酰酒石酸含量反而比果汁含量10%的品牌2#低。其次，不同品牌葡萄汁飲料的單咖啡酰酒石酸含量有差異，可能和葡萄濃縮汁或飲料的生產工藝有關，如Feryal等[13]在研究生產工藝對葡萄干中酚酸類化合物含量的影響時，發現冷凍后的葡萄汁中單咖啡酰酒石酸含量比新鮮葡萄汁降低了80%；同時還與葡萄的生長條件、氣候等因素有關[14]。

表4 市售葡萄汁飲料中單咖啡酰酒石酸的含量Table 4 Cafteric acid contents in commercial grape juice drinks

3 結 論

本實驗建立了測定葡萄汁飲料中單咖啡酰酒石酸含量的超高效液相色譜法。方法學確證表明在0.50～50.00μg/mL范圍內線性關系良好，批內及批間準確度在97.1%～106.0%，精密度(RSD)不大于4.1%，基質加標回收率在101.8%～109.0%，單咖啡酰酒石酸的工作溶液在室溫條件下24h內穩定。通過方法學的驗證考察，說明所建立的方法是準確、可靠的，可用于葡萄汁飲料樣品中單咖啡酰酒石酸含量的測定。

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