高效液相色譜法測定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度評定

趙健亞，陳 丹，謝懷根，肖 靜,*

(1.南通大學公共衛生學院，江蘇 南通 226019；2.南通市動物疫病預防控制中心，江蘇 南通 226006)

一切測量結果都不可避免地具有不確定度，測量不確定度是表征賦予被測量量值分散性的非負參數[1-2]，它可以定量表示測量結果的質量，只有附上不確定度說明才能實現檢測結果的完整表達[3-4]。磺胺類藥物屬廣譜抗菌藥，價格低廉，是治療畜禽感染的常用獸藥[5]。由于其在動物體內作用時間和代謝時間較長，易造成可食組織殘留，給人類健康帶來危害[6]。各國對動物性食品中磺胺類藥物殘留嚴格規定了限量標準，歐盟規定總殘留不應超過0.1mg/kg[7]。本實驗依據JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》[1]和CNAS—GL06《化學分析中不確定度的評估指南》[8]規定的基本方法和程序，對高效液相色譜法測定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度進行分析評定，找出主要分量，在實驗過程中重點控制從而提高檢測質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市區農貿市場隨機抽查的雞肉。

5種磺胺標準品：磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲惡唑(SMZ)和磺胺二甲氧嘧啶(SDM)(純度均為99%)，磺胺喹惡啉(SQ)(純度為97.2%) 美國Sigma公司；乙腈(色譜純) 德國Meker公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜系統(配紫外檢測器和自動進樣器) 美國Agilent公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；AB265-S分析天平 瑞士Mettler公司；AB204-N分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；R-215旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；Bond-Elut-Al-B固相萃取柱(500mg/3mL) 美國Varian公司。

1.3 樣品前處理方法

參考NY502—2001《磺胺類藥物在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法》[9]進行。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 單標儲備液的配制分別準確稱取5種磺胺標準品50mg于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，質量濃度為1mg/mL。

1.4.2 混合標準中間液的配制

分別準確吸取以上5種單標儲備液各1mL置100mL容量瓶中，用流動相稀釋并定容，得到質量濃度10μg/mL的混合標準中間液。

1.4.3 混合標準工作液的配制

按表1配制方法用流動相將混合標準中間液逐級稀釋成質量濃度為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05μg/mL的混合標準工作液。

表1 標準工作液的配制Table 1 Preparation of standard working solution

1.5 色譜條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-甲醇-水-乙酸(2：2：9：0.2，V/V)；流速：1.0mL/min；檢測波長：270nm；柱溫：室溫；進樣量20μL。

2 結果與分析

2.1 數學模型

式中：W為樣品中磺胺類藥物含量/(mg/kg)；C0為定容液中磺胺類藥物質量濃度/(μg/mL)；VX為樣液定容體積/mL；m為樣品質量/g；fr為回收率校正因子。

2.2 不確定度的來源分析

從實際測量過程和數學模型分析，磺胺類藥物殘留測定的不確定度主要來源于標準溶液配制、標準曲線擬合、樣品前處理、測量重復性等[10]。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 標準溶液配制引入的不確定度

2.3.1.1 標準物質純度引入的相對標準不確定度urel(p)

標準品證書給出SMM、SM2、SMZ和SDM的擴展不確定度為0.5%，包含因子k＝2，4種標準物質的標準不確定度均為u(p)1=0.5%/2=2.500×10-3，則urel(p)1=2.500×10-3/ 99%=2.525×10-3；證書給出SQ的擴展不確定度為1%，包含因子k＝2，其標準不確定度為u(p)2=1%/2=5.000×10-3，則urel(p)2=5.000×10-3/97.2%=5.144×10-3。

2.3.1.2 標準物質稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

2.3.1.3 標準工作液配制過程引入的相對標準不確定度urel(V)1)量器校準引入的相對標準不確定度urel(V)1

表2 量器校準引入的不確定度Table 2 Uncertainties caused by glass container calibration

表3 環境溫度變化引入的不確定度Table 3 Uncertainties caused by environmental temperature change

2.3.1.4 合成標準溶液配制的相對標準不確定度urel(std)

2.3.2 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C0)

表4 5種磺胺類藥物的標準曲線測定結果和不確定度計算Table 4 Standard curves of five sulfonamides and uncertainties

2.3.3 樣品前處理引入的不確定度

2.3.3.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m’)

2.3.3.2 試樣定容體積引入的相對標準不確定度urel(VX)

表5 5種磺胺類藥物的加標回收率測定結果和不確定度計算Table 5 Recoveries of five sulfonamides at different spike levels and uncertainties

2.3.4 樣品重復測定引入的相對標準不確定度urel(Wrep)

表6 重復測定結果和不確定度計算Table 6 Results of repeatability and uncertainties

2.4 合成不確定度及檢測結果表述

表7 不確定度評定結果Table 7 Uncertainty evaluation for the determination of five sulfonamides

3 結 論

通過對高效液相色譜法測定雞肉中磺胺類藥物殘留的不確定度各分量的評定，可見最終結果的不確定度主要由標準曲線擬合、樣品前處理過程和測量重復性引起，其次為標準溶液配制過程。實際操作過程中可通過增加混合標準系列工作液測定次數、優化樣品前處理方法、增加平行樣測定及選擇精度較高玻璃量器來減小引入的不確定度，從而提高檢測質量。

[1] 國家質量技術監督局. JJF 1059—1999測量不確定度評定與表示[S]. 北京： 中國計量出版社, 1999.

[2] JCGM 200： 2008, International vocabulary of basic and general terms in metrology(VIM). 3rd edition[S]. BIPM and ISO, 2008.

[3] 國家質量技術監督局計量司. 測量不確定度評定與表示指南[S]. 北京： 中國計量出版社, 2000.

[4] ISO-ISBN 92-67-10188-9 Guide to the expression of uncertainty in measurement[S]. Geneva, 1995.

[5] 沈建忠, 謝聯金. 獸醫藥理學[M]. 北京： 中國農業大學出版社, 2000： 155.

[6] 李俊鎖, 邱月明, 王超, 等. 獸藥殘留分析[M]. 上海： 上海科學技術出版社, 2002： 232.

[7] The Commission of the European Communities. Council Regulation (EEC) No 2377/90 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin[J]. Off J Eur Commun, 1990, 62(2)： 16-17.

[8] 中國合格評定國家認可委員會. CNAS—GL06 化學分析中不確定度的評估指南[S]. 北京： 中國計量出版社, 2006.

[9] 中華人民共和國農業部. NY 5029—2001 無公害食品豬肉附錄E磺胺類藥物在動物可食性組織中殘留的高效液相色譜檢測方法[S].

[10] 國家質量監督檢驗檢疫總局. JJF 1135—2005 化學分析測量不確定度評定[S]. 北京： 中國計量出版社, 2005.

[11] 國家質量監督檢驗檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規程[S]. 北京： 中國計量出版社, 2006.